Name: voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

ברצוננו להודות לד&quot;ר Claycomb למתן תאי HL-1 ופרוטוקול תחזוקה מפורט. כמו כן, אנו רוצים להודות לגב &#39;אלנה קאריו וד&quot;ר סת Robia על סיועם ביצירת סרט התא ומר פיט קארון לעזרתו בהכנה כמה אבזרים למערכת הערוץ הכפולה שלנו מיפוי אופטי. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 לXA), המכונים הלאומי לבריאות (HL113640 לXA), וויולה אוניברסיטת מחקר קרן לפיתוח (לXA).

1. פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוראפינפרין פתרון (NP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 40 מ&quot;ג של NP ל -25 מיליליטר של 30 מ&quot;מ חומצה אסקורבית (חומצה אסקורבית .1475 g ב -25 מיליליטר מים מטוהרים מילי- Q (MQ). הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל נוראפינפרין (NP) הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את פתרון NP עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot הפתרון לmicrotubes סטרילי 1 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. ברגע שהוקפא, NP יציב למשך חודש אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת בתוספת לשטוף וסופי Claycomb <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם 43.5 מיליליטר של מדיום Claycomb ולהשלים עם 5 מיליליטר של סרום שור העוברי (FBS), 0.5 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין, 0.5 מיליליטר של NP ו -1: 100 בדילול מלא L-גלוטמין לעשות 50 מיליליטר של מדיום Claycomb בתוספת סופי. הימנע מחשיפה לאור ישירה במהלך הכנת פתרון זה בגלל בינוני Claycomb הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לשטוף Claycomb משתמש באותו המתכון כמו supבינוני ליישמם Claycomb מלבד להוסיף 5% FBS ולהשמיט את NP ורכיבי L-גלוטמין. הערה: התקשורת הסופית ולשטוף Claycomb תוספת טובה לשבועיים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס ללא חשיפה לאור ישירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מעכב טריפסין סויה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 25 מ&quot;ג של מעכבי טריפסין סויה לתוך של פוספט Ca-חופשי וMg-חופשי של Dulbecco שנאגרו 100 מיליליטר (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. הערה: הפתרון מעוקר הוא יציב למשך חודש אחד, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לטין / פתרון ציפוי צלחת פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.1 גרם של ג&#39;לטין לתוך 500 מיליליטר של מים MQ לעשות ג&#39;לטין 0.02%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי, ואז לדלל 1 מיליליטר של פיברונקטין לתוך 199 מיליליטר של ג&#39;לטין 0.02% ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 6 מיליליטר של תמיסת הג&#39;לטין לתוך צינורות נפרדים ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מלח &#39;הנקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מערבביםצלחת, לפזר את מלחי הבאים במי MQ (mmol / L), NaCl (136.9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (.4409), Nah 2 PO 4 (.4000), MgSO 4 (.8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (סך של 5.042), CaCl 2 (1.261). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבע רגיש סידן פתרון (Rhod2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 מ&quot;ג של אבקה יבשה Rhod2 ב400 μl של 20% pluronic F-127 בDMSO לעשות Rhod2 לצבוע פתרון מניות ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון הזה מניית 1: 1,000 בפתרון מלח &#39;הנקס לעשות פתרון סופי עובד לפני תחילת הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבע רגיש מתח פתרון (Rh237) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 מ&quot;ג של Rh237 עם 2 מיליליטר של DMSO לעשות פתרון מניות ולאחסן ב -20 ° C. לדלל את מניות הפתרון 1: 1,000 בפתרון מלח &#39;הנקס לעשות פתרון סופי עובד לפני תחילת הניסוי. </li></ol></li></ol> &amp; #160; הערה: 1-4 פתרונות מבוסס על פרוטוקול תרבית תאי Claycomb HL-1 עם שינוי קל. 2. Passaging וCulturing HL-1 myocytes פרוזדורים על Coverslips הערה: ניתן להשיג תאי HL-1 מד&quot;ר Claycomb (אוניברסיטת מדינת לואיזיאנה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול HL-1 תאים בצלוחיות T25 ולהאכיל עם 5 מיליליטר של Claycomb בינוני בתוספת יומית. מעבר התאים בT25 צנצנות בחמישה ימים על פי פרוטוקול Claycomb HL-1 תרבית תאים (שיפורט להלן) 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips המקום העגול (קוטר 20 מ&quot;מ) לתוך צלחות תרבות 12 גם 24 שעות לפני תאי בקבוק T25 הם מחוברות באופן מלא ומוכן לpassaged, ולאחר מכן לכסות את coverslips עם ג&#39;לטין / פיברונקטין הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום, לשאוב והבא זורק את הג&#39;לטין / פיברונקטין מצלחות התרבות ולהחליף גם 1.5 מיליליטר של מדיום הסופי Claycomb תוספת בכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים מcultur T25בקבוק דואר לאחר שהגיע למפגש מלא ביום 5. לשאוב בינוני מהבקבוק T25 המכיל את התרבות ומחוברות ולשטוף את התרבות קצרה עם PBS על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס ידי pipetting טריפסין / EDTA על החלק התחתון של בקבוק T25 כדי למנוע מגע ישיר עם התאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר טריפסין / EDTA על ידי שאיפה ולהוסיף עוד 1.3 מיליליטר של טריפסין / EDTA לכל בקבוק T25. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1 דקה. בדוק תחת מיקרוסקופ ואם תאים עדיין מחוברים לבקבוק, הקש כדי לסלק באופן מלא תאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.3 מיליליטר של מעכבי טריפסין הסויה לתאים ותאי העברה מהבקבוק לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. יש לשטוף את הבקבוק הריק עם 5 מיליליטר של מדיום לשטוף Claycomb. להוסיף את לשטוף את התאים בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ועדינות מחדש להשעות את התא גלולהב 6 מיליליטר של מדיום הסופי Claycomb בתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים היטב בכל צלחת 12 גם עם 0.5 מיליליטר של השעיה תא מתאי passaging. להאכיל את התאים עם מדיום הסופי Claycomb טרי בתוספת יומית. הערה: באופן קרוב לפקח על הצמיחה של התאים, בדרך כלל monolayers התא להגיע למעמד ומחוברות ביום 4 והפעילויות הספונטניות יישארו גלויות. לאחר מכן, monolayer התרבותי יהיה מוכן למיפוי אופטי ביום 4-5. </li></ol> 3. סידן טעינה ומתח צבעים רגישים לתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי מיפוי אופטיים, להסיר בעדינות את coverslip מצלחת תרבית תאי 12 גם ולשטוף עם תמיסת מלח &#39;הנקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים תאים עם הצבע רגיש Ca Rhod2, דגירה monolayer התא על coverslip עם 3 מיליליטר של חומץ (מבעבע עם 5% CO גז O 2 2/95%) פתרון Rhod2 עובד על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את התאים עם צבע רגיש מ &#39;VRh237, לטבול את monolayer התא הטעון Rhod2 ל 3 מיליליטר של תמיסת חומץ Rh237 עובדת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות נוספות. </li></ol> מיפוי 4. ערוץ כפול האופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את monolayer התא, שהוא כפול מוכתם במ &#39;V וצבעים Ca, לחדר מחזור במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. השתמש במערכת דם מחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה של החדר בתא C ° 35 ± 1. לשלוט בזהירות את הטמפרטורה של perfusate על ידי התאמת מהירות הזרימה במחזור דרך החדר כדי להימנע משיפוע של יותר מ -0.3 מעלות צלזיוס פני התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההקלטה מ &#39;V / אותות Ca, לשטוף את monolayer התא עם פתרון הנקס טרי לכ 5 דקות כדי להסיר את הצבע שנותר ממדרגות הצביעה הקודמות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers תא בריא קצב באמצעות אלקטרודה דו קוטבית המורכבת מפיפטה זכוכית מלאה בתמיסת מלח &#39;הנקס וsilvאה החוט הכרוך סביב קצה פיפטה כמו בעבר תאר 12,17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> monolayers קצב הבריא של תאים באורך מחזור של 200-500 רוחב msec ודופק של 2 אלפיות שניים, מצפה לסף צעדה בכ 1 mV. הערה: לכל אצווה של monolayers התרבותי, יש להשתמש בלפחות שני monolayers שאינם מטופלים על מנת לבחון את מצבו של התא אצווה. monolayers שליטה הבריא צריך להיות מסוגל להיות שנתפס על ידי קיצוב חשמל באורכי מחזור של 200-500 אלפיות שני. אם monolayers השליטה לא מצליח להיות בקצב חשמלי, זה מצביע על כך שכל התא אצווה עשוי שלא להיות מתאים לניסויי מיפוי אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את שני מ &#39;V וצבעים רגישים Ca, שימוש במקור אור LED (520 ננומטר אורך גל) בשילוב עם מסנן עירור (510 ננומטר / 40) ומראה dichroic (561 ננומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אותות ניאון הנפלטים על ידי התאים באמצעות אובייקטיבי 40X ופיצול עם מראה dichroic (594 ננומטר) לרכיב מ &#39;V ומרכיב Ca.סנן את האור הנפלט בערוץ מ &#39;V עם מסנן ארוך לעבור (700 ננומטר) והאור הנפלט בערוץ Ca עם מסנן לעבור להקה (585/40 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אור הניאון המסונן באמצעות שתי מצלמות CCD (80 x 80 פיקסלים, 1,000 תמונות בשניה; חולצה אדומה הדמיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע photobleaching צבע, לבצע הקלטות בפחות מ 2 שניות על כל שדה הראייה להגביל את הזמן של חשיפה לאור. כאן, בדרך כלל תמונה ארבעה תחומים שונים לכל שכבה. </li></ol></li></ol> 5. עיבוד נתונים של m V או הקלטות Ca <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשניהם מ &#39;V ואותות Ca (80 x 80 פיקסלים), ממוצע ערכי העצמה של עשרים וחמש (5 x 5) פיקסלים שכנים לערך עוצמה אחד בנקודות זמן הקלטה שונות כדי להפחית את רעש רקע. הערה: לאחר מיצוע הנתונים, כל נקודת זמן הקלטה של ​​פוטנציאל פעולה בודד או חולף Ca מניבה מטריצת נתונים המכילה 16 x 16 בממוצע ערכי עוצמה (בממוצעערוצי נתונים) עם רזולוציה מרחבית של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר זמן הפעלה (AT) של מטר V מוקלט או אותות Ca. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר זמן הפעלה (AT) של פוטנציאל פעולה בודד או חולף Ca, לקבוע את הזמן של 50% משיא של משרעת מ &#39;V או אותות Ca באמצעות אלגוריתם המבוסס על MATLAB מחוייט כפי שתואר לעיל. 12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני להגיה ATS ניתח לחסל את כל שגיאות שעלולות להתרחש במהלך ניתוח התכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות המוגדר במטריקס (16 x 16 בממוצע נתוני ערוצים) של פוטנציאל פעולה נרשם וחולף סידן, בהתאמה, בתוכנה בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב פוטנציאל פעולה או וקטורי סידן חולפים מהירות הולכה (CV) במטריצת AT תוך שימוש בשיטת ניתוח שדה וקטורים כפי שתואר לעיל עם שינויים קלים 12,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את וקטור קורות החיים של ערוץ נתונים ביחס לסביבתו בנקודות נתונים (5 ×; 5 שכנים בממוצע ערוצי נתונים) כדי לדמות משטח חלק פולינום פעמים הפעלה (על פני שטח) באמצעות אלגוריתם לפחות מרובע בתכנית MATLAB 12,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב וקטור הולכה תוך שימוש בנוסחות שלהלן פורמולה 1: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> פורמולה 2: θ = arctan [(dy / DT) / (DX / DT)] הערה: Ve היא וקטור קורות חיים המוקרנים בקואורדינטות x ו- y צירים; dx / dt היא ההשלכה של וקטור קורות החיים בציר X; dy / dT הוא ההשלכה של וקטור קורות החיים בציר y. T הוא משטח AT; x, y מתייחס ל2-D מרכז; T x = ∂T / ∂x הוא נגזר החלקית של T ביחס לx; y T = ∂T / ∂y הוא נגזר החלקית של T ביחס לy; θ הוא הכיוון הסופי של וקטור קורות חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצה כל הווקטורים של מטריצת AT ל -36 מסלולים, כל אחד מהם מכסים מגזר עשר מעלות במצפן. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המסלול המכיל את האוכלוסייה הגדולה ביותר של וקטורי קורות החיים בין מסלולי ההולכה 36. לחשב את קורות החיים הממוצע של מסלול זה לייצג את קורות החיים של השכבה. </li></ol></li></ol> 6. ויזואליזציה של התפשטות גלים הפתוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את עוצמת האות של פוטנציאל אישי פעולה או חולף Ca בנקודות זמן הקלטה שונות ביחס לשווי השיא שלה באמצעות תוכנת MATLAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן זמני לאחסן את נתוני עוצמת המנורמל של כל נקודת זמן שנרשם למטריצת עוצמה 16 x 16 בתוכנת MATLAB בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות מפת עוצמה בצבעים ממטריצת העצמה מאוחסנת של כל נקודת זמן הקלטה באמצעות פונקצית surf.m. הערה: במפת העצמה, אדום מייצגת בעוצמה גבוהה של מטר V או אותות Ca, וכחולה משקפת בעצימות נמוכות של אותות הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור קובץ .avi באמצעות פונקצית avifile.m. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל iמפות ntensity בנקודות זמן הקלטה שונות של פוטנציאל הפעולה או חולף Ca באמצעות פונקצית addframe.m. הערה: בשלב זה, שני קבצי avi נפרדים של m V והתפשטות Ca יופקו. </li></ol>

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts.">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12 (Unit 12 17), (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium.">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li><li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias:+role+of+intracellular+calcium.">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li><li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes.">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer.">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li><li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes.">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2++channels+in+murine+HL-1+cells.">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li><li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-1+cells:+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte.">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li><li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias.">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li><li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+physiology+at+the+cellular+level:+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function.">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li><li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes.">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li><li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation.">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li><li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model.">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li><li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures.">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li><li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data.">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

מאמר זה מתאר את ההיבטים המרכזיים של מיפוי אופטי בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 מוכתמת בצבעי ניאון רגישים סידן ומתח. זה כולל culturing monolayer אופטימלי HL-1 תא, התקנה של ציוד המיפוי, מיפוי monolayer תרבותי, וניתוח נתונים. כדי למפות בהצלחה תאים בתרבית, המפתח הוא להכין monolayer תא מפוזר באופן אחיד. כאשר זריעת התאים לcoverslips, להיות בטוח כדי לפזר באופן שווה את התאים. תמיד מפת monolayers תא מלאה גדל ומחוברות לחלוטין, כמו אלה יגיבו הטובים ביותר לצעדה חשמלית. כמו כן, חשוב לשמור על התאים מחומצן בעת ​​טעינת הצבעים, אבל בועות החמצן לא צריכה לבוא במגע ישיר עם התאים כמו זה עלול להרוג או לסלק אותם מcoverslip. הפחתת ריכוז לצבוע והפחתת עוצמת אור יקטן גודל אות ולהפחית יחס אות לרעש, תוך הגדלת concentrati צבעובשיפור עוצמת אור יגדל עוצמת אות, אלא גם להגדיל את הרעש. לכן, איזון אופטימלי של ריכוז צבע ניאון וכוח אור העירור צריך להיקבע על מנת לשפר את יחס האות לרעש של אותות הקלטה. יתר על כן, בעת הקלטת מיפוי אופטית, להיות בטוח כדי למנוע חשיפה של monolayer התא לחשיפות של אור מרוכז כל עוד זה עלול לגרום לניזק לתאים פוטודינמי בתחום האור חשוף. לבסוף, מערכת מיפוי אופטית המספקת רזולוציה של זמן ומרחב גבוהה של אותות הקלטה נדרשת לקבלת נתונים באיכות גבוהה. בעוד מיפוי אופטי ערוץ כפול בלב שלם יש פוטנציאל גדול ללימוד electrophysiology לב בשל יכולתו לאותות מתח וסידן לאסוף בו-זמנית, מגבלה אחת היא שטכניקה זו אוספת מידע משטח 3-D כמפת הקרנת 2-D. הנתונים שהתקבלו 2-D מלב שלם עם מידע התעלם מcurvat 3-Dיור של הלב יכול לגרום לשגיאות נתונים בניתוחים, במיוחד בניתוח מהירות הולכה. עם היתרונות של שימוש HL-1 מודל 2-D בתרבית תאי, אנו מסוגלים לדמיין מקצבים קבועים וסדירים, להעריך חולף Ca וקינטיקה פוטנציאל פעולה, לקבוע מהירות הולכה ולאפיין Ca ודפוסי התפשטות פוטנציאל פעולה (אחיד או שאינה התפשטות אחידה) בלי להתערב ממבנה 3-D של לב שלם. לכן, מיפוי בהצלחה שני ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה בשכבת myocyte פרוזדורים תרבותית HL-1 כגישה חינם יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של מאפייני אלקטרו של myocytes פרוזדורים והמנגנונים של arrhythmogenesis פרוזדורים.

סידן ייחודי (Ca) ומתח (מ &#39;V) טכניקת מיפוי אופטי ערוץ כפול 1-5 מתגלה ככלי יעיל כדי להקליט בו זמנית אותות מ&#39; V וCa בשני לבבות שלמים וmonolayers תאים בתרבית. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע רב עוצמה ביחס למערכת היחסים בין ארעיים סידן ופוטנציאל פעולה כדי להבין טוב יותר את מנגנוני אלקטרו הבסיסיים של הפרעות בקצב לב. monolayers תאים בתרבית הוכיח להיות מודל סלולארי שימושי ללמוד electrophysiology לב ואת המנגנון הבסיסי של הפרעות קצב. 4,6-8 HL-1 תאים קו תרבות myocyte פרוזדורים מאופיינים היטב. תאי HL-1 גם לשמור על גנוטיפ מובחן באופן ייחודי ופנוטיפ הכולל מורפולוגיים, אלקטרו, ומאפיינים תרופתיים של myocytes פרוזדורים המבוגר. תאים אלה מבטאים גני לב וחלבונים, כולל importaNT יון לב ערוצים (כלומר, L- וערוצי סידן T-סוג) 9 וisoforms הבוגר של חלבוני התכווצות sarcomeric בדרך כלל נמצא בmyocytes פרוזדורים מבוגר כמו אחרים ויש לנו שדווח בעבר. 10-13 בנוסף, HL-1 תאים יכולים להיות בתרבית כדי ליצור monolayer myocyte 2 ממדים (2-D). לפיכך, היתרונות של שימוש monolayers HL-1 התרבותי כוללים: 1) עלות וקלה יותר יחסית נמוכות כדי לשמור על קו תרבות myocyte מאשר הבידוד וculturing myocytes ילוד הראשוני; 2) monolayer ומחוברות של תאים מפחיתה את המורכבות המבניות הנובעות ממבנה 3-D של הלב; 3) monolayer תא יכול לחסל את ההפרעה של סיסטיק ביניים המתרחשת בלב שלם. זה יכול לשמש כדי לנתח פונקציות אלקטרו ספציפיות של קבוצה של myocytes ללא התערבות של fibroblasts ומטריצת ביניים; 4) הערכה של השלכות תפקודיות ממניפולציה תרופתית או גנטית ברחוב ללא מוצאmonolayers תא tured ניתן להשיג ביעילות. לכן, HL-1 תאים הפכו למודל סלולארי בשימוש נרחב ללימוד היבטים שונים של הפיסיולוגיה myocyte כמו גם פעילויות חשמליות חריגות מושרה צעדה. 13-16 monolayers תא בריא עם זאת, טיפול וטיפול מיוחד נדרש לתרבות המגיבים לחיצוני צעדה חשמלית ללימודי מיפוי אופטיים. בנוסף, הליך מכתים צבע ניאון כפול עשוי בקלות לגרום נזק לשלמות monolayers תא ומחוברות בתרבית. לפיכך, מ &#39;V ביצוע / מיפוי אופטי ערוץ כפול CA בmonolayers HL-1 בתרבית היה אתגר גדול. מטרתה של שיטה זו היא לספק את השלבים העיקריים לביצוע בהצלחה מיפוי אופטי ערוץ כפול בmonolayers HL-1 בתרבית. כאן יש לנו סיפקנו פרטים רבים על פרוטוקול מותאם להכנת monolayer HL-1 התא, מיפוי אופטי ערוץ כפול של monolayer תאים בתרבית, ועיבוד נתוני מיפוי.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 dry powder</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

מיפוי אופטי הוכיח להיות טכניקה יקרה כדי לזהות פעילות חשמלית של הלב על שני לבבות לשעבר שלם vivo ובmonolayers myocyte התרבותי. תאי HL-1 היו בשימוש נרחב כמודל סלולארי 2 ממדים ללימוד היבטים שונים של פיזיולוגיה של לב. עם זאת, זה כבר אתגר גדול לסידן המפה אופטי ארעיים (Ca) ופוטנציאל פעולה בו זמנית מאותו שדה הראייה בשכבת תא פרוזדורים תרבותית HL-1. סיבה לכך הוא טיפול וטיפול מיוחדים נדרש כדי להכין את התאים בריאים שיכול לנפול בפח חשמלי וממופים אופטי. לכן, פיתחנו פרוטוקול עבודה אופטימלי למיפוי אופטי ערוץ כפול. בכתב היד הזה, שתארנו בפירוט כיצד לבצע את ניסוי מיפוי אופטי ערוץ הכפול. פרוטוקול זה הוא כלי שימושי שנועד לשפר את ההבנה של התפשטות פוטנציאל פעולה וקינטיקה Ca בפיתוח הפרעות קצב.

<html> Monolayer ומחוברות תרבותית מציגה קצב פנימי רגיל, כפי שהודגמה בסרט 1. לאחר מכן, אנו מבוצעים מ &#39;V מיפוי אופטי ערוץ כפול / Ca בשכבה HL-1 ומחוברות באופן מלא. איור 1 א מציג עקבות דוגמא מ&#39; V ואותות Ca מנרשם בודד הכה. מפות isochronal נציג מ &#39;V מופץ באופן אחיד ואותות Ca באמצעות מערכת המיפוי אופטי ערוץ הכפולה מוצגות ב1B דמויות ו1C. תמונות כרונולוגי נציג של פוטנציאל פעולה מופץ באופן אחיד וארעיים Ca התקבלו מאותה התרבות monolayer HL-1. לבסוף, סרטים 2 ו -3 לספק דוגמאות אנימציה של פוטנציאל מופץ באופן אחיד פעולה (סרט 2) וסידן חולף (סרט 3) בשכבה ומחוברות HL-1. <html> -page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52542/52542fig1highres.jpg" /> איור 1: () עקבות דוגמה למ &#39;V (כחול) וCa (אדום) מפעימה חשמלית בקצב באורך מחזור (CL) של 500 אלפיות שניים. (ב) תמונה של מערכת המיפוי האופטית שלנו לHL-1 monolayers. מפת isochronal של התפשטות פוטנציאל פעולה מאותו הפעימה בקצב לאורך כל שדה הראייה (C). מפת isochronal של התפשטות חולפת Ca מאותה הפעימה בקצב לאורך כל שדה הראייה (D). בשתי מפות isochronal, זמן לשגות מיוצג עם צבעים, מתחיל בכחול כהה ייזום ואדום כהה ב 50 אלפיות שניים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/52542fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /52542/52542fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2: (א) בסדרת מפות של הפצה מ &#39;V של 60, 80, 140, ו -200 אלפיות שני לאחר תחילת ההקלטה. (ב) מפות של הפצת Ca ב 60, 80, 140, ו -200 אלפיות שני לאחר תחילת ההקלטה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/looped HL-1 7-20-14.avi">סרט 1:</a> סרט נציג נרשם ממחוברות monolayer HL-1 ביום תרבות חמש, תחת מיקרוסקופ אור עם מטרת 40X. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/vm 07_21_14 jy.avi">סרט 2:</a> סרט מייצג של פוטנציאל פעולה מופץ מפעימה בקצב בCL של 500 אלפיות שניים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52542/ca 07_21_14 jy.avi">סרט 3:</a> סרט מייצג של חולף Ca מופץ מpaced הכה בCL של 500 אלפיות שניים.

Watch this Scientific Journal Video about Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer at JoVE.com

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Video: Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Medicine

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video