Name: a method of nodose ganglia injection in sprague-dawley rat
Uploaded: 2014-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
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이 연구는 국립 보건원 (부여 1UM1HL112856)에 의해 지원되었다.

모든 절차 및 프로토콜은 시카고 일리노이 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 여기에 설명 된 실험은 급성 비 생존 실험, 그리고 눈 연고의 아무 소용이 없었다. 수술 도구가 DIH O. 2에서 70 % 에탄올로 세척하고, 멸균 조건의 경우에만 발생 정비 실험의 끝에 쥐의 희생은 IV 케타민 / 자일 라진 (xylazine)의 과다 복용을 통해 발생했습니다. 악기 및 화학 1. 준비 <ol><li> PBS에서 0.05 M 5-HT의 염산 원액을 준비합니다. 이어서 0.203 ㎜의 최종 5-HT의 농도로 PBS에 희석 스톡. </li><li> 20 ㎍ / μL의 농도 참기름 dronabinol을 희석. </li><li> (PE) -50 튜브 (ID 0.58 mm, 외경 0.965 mm) 폴리에틸렌의 20cm 길이를 잘라. 호스의 일단 부에, 가위를 사용하여 경사 팁을 절단하고, 다른 단부에서 정사각형, 23g 바늘을 삽입한다. 1 ml의이 23g 바늘을 연결주사기, 50 U / ㎖ 헤파린의 0.3 ml로 그것을 채우십시오. </li><li> 4-0 꼰 실크 스레드의 네 가지를 잘라 옆으로 설정합니다. </li><li> DIH 2 O.에, 70 % 에탄올로 2 곡선 Graefe 씨 집게, 3 마이크로 클램프를 수술 가위를 소독 </li></ol> 대퇴 정맥의 2 도관 카테터를위한 프로토콜 제스 퍼슨 등의 알에서 수정됩니다. (21) <ol><li> (10 ㎎ / ㎏ 100 ㎎ / ㎏) 복강 내 (IP) 케타민 / 자일 라진 (xylazine)와 스프 라그 - 돌리 쥐를 마취. 쥐의 발가락을 꼬집어 및 마취의 적절한 수준을 확인하는 움직임을 관찰합니다. 왼쪽 허벅지 복부 측면에서, 그리고 목 복부 측면을 면도. 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 필요한 경우 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 수술 보드에 앙와위에서 보안 쥐. 왼쪽 뒷다리 허벅지에서 피부를 절개하는 수술 용 가위를 사용합니다. </li><li> 집게를 사용하여, 행동 무딘 dissectio피상적 근육의 n은 대퇴 정맥을 노출. 대퇴 정맥 주위에 2 스레드를 대퇴 동맥에서 정맥을 분리하고, 배치 집게를 사용합니다. </li><li> 풀업하는 정맥 혈액의 흐름을 중지 곡선 Graefe 씨의 집게를 사용합니다. 22 G 주사기 바늘을 사용하여, 대퇴 정맥에 구멍을 후 정맥에 PE-50 튜브의 경 사진 끝을 삽입합니다. </li><li> PE-50 튜브가 주사기의 플런저를 후퇴 올바르게 삽입되었는지 확인합니다. 혈액은 PE-50 튜브를 입력보아야한다. 2 스레드를 사용하여 정맥 및 PE-50 튜브 약 2 매듭을 묶어. </li></ol> 3. IV 주입을 통해 가사를 5-HT 유도 <ol><li> 호흡을 측정하기 위해 쥐의 주위에 압전 스트레인 게이지를 놓습니다. </li><li> 컴퓨터 증폭기 소프트웨어를 통해 전자 증폭기의 증폭 레벨에 대한 설정 변경 : 증폭 (100X) 및 대역 통과 필터 (1-10 Hz에서) 스트레인 게이지에 의한 호흡 신호, AT &amp; &quot;highpas 필터&quot;로 설정8220;. 총 이득 &quot;에 대한&quot;10 Hz에서, &quot;와 입력하여 증폭을 설정&quot;(10)를 초기 이득 &quot;에 대한&quot; &quot;와&quot;100 &quot;&quot;에서 &quot;AC @ 1 HZ&quot;과 &quot;로우 패스 필터. </li><li> 컴퓨터에 기록 소프트웨어를 통해 &quot;아날로그 입력&quot;을 열어 샘플링 속도에 대한 설정을 변경합니다. &quot;1000 Hz에서&quot;와 AT, &quot;샘플&quot;아날로그 - 디지털 변환기를 사용하여 (500 Hz의 샘플링 레이트)를 디지털화하는 것은 &quot;1&quot;(유효 샘플링 속도 500 Hz에서)에 의해 다른 모든 기록 지점 &quot;SKIP&quot;을 선택한 후, 신호를 기록 기록 소프트웨어를 사용. </li><li> 카테터에서 1 ML의 주사기를 제거하고 카테터에 5-HT의 0.203 mM의 가득 500 ㎕를 정밀 유리 주사기를 삽입합니다. </li><li> 주입 펌프에 500 μL 정밀 유리 주사기를 놓습니다. 63 ㎖ / hr의 속도로 350 μL / 5-HT 용액 kg 당 12.5 ㎍ / kg 달이다. 을 볼 수 쥐에서 여러 주입을 수행하고 관찰 무호흡증,컴퓨터 모니터에 기록 된 호흡 신호에 (≥ 2.5 초) 호흡에 일시 정지 SA. </li><li> 목 수술을 진행하기 전에, 패턴 호흡 모니터링하고 쥐의 발가락 핀치에서 통증 반사를 확인합니다. 호흡이 불규칙하거나 발가락 핀치로부터 반사 통증이 있으면, IP 케타민 / 자일 라진 관리하는 경우 (100 ㎎ / kg : 5 ㎎ / kg)을 한 후 마취의 적절한 수준을 다시 확인한다. </li></ol> 4. 목 수술 Nodose 신경절을 노출 <ol><li> 수술 보드에 앙와위에서 보안 쥐. 목에 수술 가위를 사용하여 중간 선 길이 절단을 확인합니다. </li><li> (수술 부위의 명확한이 근육을 유지하기 위해 2 마이크로 클램프를 사용) 활 경근 근육에 무딘 절개를 사용하여 sternohyoideus 및 omohyoideus 근육을 노출. 내 경동맥과 그 가지 중 하나 pterygopalatine 동맥을 노출이 근육을 분리합니다. </li><li> 이 일을 따라하고 내 경동맥을 따라 실행으로 미주 신경을 준수<html> 전자 pterygopalatine 동맥. 설인 신경 (뇌신경 IX) 및 척추 부신경 (뇌신경 XI)와 함께 미주 신경과 pterygopalatine 동맥, 두개골의 바닥에있는 후방 찢 난원를 입력하는 방법을 준수하십시오. </li><li> nodose 신경절은 (는) 후방 찢 난원에 진입하기 직전 미주 신경의 부종으로 표시되는 것을 알 수 있습니다. 또한 인두와 후두 신경 가지 nodose 신경절의 각각 전방 및 후방 측면을 벗겨 것을 알 수 있습니다. (5) </li><li> Graefe 씨 집게를 사용하여 동맥으로부터 미주 신경을 분리하고, 미주 신경 주위의 실 부재를 배치했다. 미주 신경에 약간 긴장을 적용하고, 주입 할 때 더 적은 저항을 제공하기 위해 모든 결합 조직의 nodose 신경절을 청소 스레드에서 클램프를 놓습니다. </li><li> 손상이 nodose 신경절에 수행되지 않았 음을 확인하기 위해 제 3 항에 명시된대로 5-HT 유도 가사를 반복합니다. </li></ol>Dronabinol의 &#39;타이틀 &quot;&gt; 5. Intranodose 신경절 주입 <ol><li> 참기름 dronabinol의 5 μL와 팁을 경사 35 °와 맞춤 28g 반 인치 주사기 바늘에 부착 된 10 μL 기밀 정밀 유리 주사기를 입력합니다. </li><li> 미주 신경에 약간 긴장을 적용하고, 그것을 뚫하지 nodose 신경절 돌보는에 구멍을하는 스레드에서 마이크로 클램프를 놓습니다. 주사기의 전체 내용을 천천히 주입 주사기 (≥ 60 초)을 밟아. 주사기의 내용 중 일부는 신경절에서 누출합니다. </li><li> 3 장에서 언급 한 바와 같이 반복 무호흡증 5-HT는 유도. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

nodose 신경절에 신경 화학 물질을 성공적으로 주입을위한 중요한 단계는 1) 식별하고 nodose 신경절 오프 결합 조직을 청소; 2) 주입하기 전에 nodose 신경의 무결성을 확인하는 단계; 3)과 섬세에 주입하는 작은 게이지 바늘을 사용하지만, 완전히, nodose 신경절을 통해 천공 없습니다. 미주 신경을 목에서 많은 복부 장기 innervates, 이러한 CNS 심박수, 혈압, 기관지 자극, 및 위장관 팽창으로 중요한 정보를 중계한다. 미주 신경의 nodose 신경절은 아미노산, 모노 아민, 신경 펩티드 및 기타 신경 화학 물질에 대한 수용체의 다양한 배열을 포함하고 있습니다. 그 수용체 신경 화학 물질의 1 Intranodose 신경절 주사를 미주 신경의 활동을 수정, 16, 17 전에 수행 된 주변 pharmacologi을 규명 할 수있는 훌륭한 실험 모델을 나타냅니다수면 무호흡증, 위 식도 역류 질환, 만성 기침 등의 질병을 수정할 수있는 미주 신경에 칼 효과. 2-4 nodose 신경을 노출하기 위해 목 수술을 실시하고, 목의 근육은 경동맥을 노출 구분됩니다. 미주 신경은 내부 경동맥과 pterygopalatine 동맥을 따라 실행 볼 수 있습니다. 유니 폴라 미주 신경의 세포 기관은 후방 찢 구멍으로의 두개골에 들어가기 전에 미주 신경의 부종으로 볼 수 있습니다 nodose와 petrosal 신경절에 위치하고 있습니다. (5) nodose 신경의 조작은 nodose 신경과 미주 신경은 수술 중 손상되지하는 한 것이 중요하다. 부적절한 원유 수술 기술은 동맥과 다른 뇌신경과 함께 nodose 신경과 신경 가지를 손상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 미주 신경을 안정화하기 위해, 우리는 vagu에 약간의 장력을 제공한다실크 스레드를 통해의 신경은 마이크로 클립에 첨부. 이 적절가 더 어려워 nodose 신경절에 주입 할 수 있도록 수있는 결합 조직을 청소하는 우리를 할 수 있습니다. 또한, 우리는 nodose 신경절은 5-H​​T의 주입에 의해 무호흡을 유도하여 주입을 진행하기 전에 그대로 있는지 확인합니다. nodose 신경절에 주입하기 위해, 우리는 (28 G, OD 362 μm의) 정밀 유리 주사기에 부착 된 바늘 저렴 작은 게이지를 사용했다. 주사 부위의 깊이 nodose 신경절 통해 천공 방지 할 우려 때문에, 주사기의 끝이 경 사진 35 °의 지정 수 직각보다 만들었다이었다. 이것은 유리 마이크로 피펫을 사용하는 다른 기술 마이크로 인젝션 상이 8-10,14-16 유리 마이크로 피펫의 장점은 작은 선단 직경이다.; 그러나, 유리의 취약성에 절차를 수행하는 동안 끝을 파괴의 위험이 있습니다. 또한, 고가의 장비가없는 모든 실험실이 소유 할 수 있습니다 유리 마이크로 피펫을 끌어 필요. 주문 제작 바늘 파괴의 위험이 없다, 그들은 유리 마이크로 피펫 (20 ~ 100 μL)에 비해 더 큰 직경 (362 μm의) (17) 이었지만, 8,9,14-16 바늘 nodose 신경절 여전히 충분히 작았 주사. 또한, 이러한 바늘은 많은 실험 재사용했고, 마이크로 피펫을 추출하는 데 사용 장비에 비해 상당히 적은 비용이었다. 인해 nodose 신경절에 주입을 위해 사용 맞춤 니들 크기로, 그것은 nodose 신경절에 존재하는 경우, 손상을 평가하는 것이 중요하다. nodose 신경절 손상을 평가하는 하나의 방법은 신경절 nodose 학적 처리 및 현미경을 통해서이다. 6-9,13,15 심성 미주 신경 기능을 평가하기 위해,이 프로토콜에서 사용되는 제 2 방법은, 전기 생리 학적 또는 행동 사이의 결과를 비교한다 실험 및 제어 분사 그룹. 14 ~ 17 Dronabinol 주사는 C에 비해 5-HT 유도 가사를 감쇠하는 것으로 나타났다조작부 주사, 더 큰 직경의 정의 바늘에서 일부 피해가 발생했을 경우, dronabinol에 의해 억제되었다 아직 충분한 기능 nodose 신경절 세포가 있다고 의미 (17). 기능적 결과 (즉, 무호흡)이이 프로토콜의 중요한 메트릭 된 이후 이와 유사하게, 기름에 dronabinol의 5 μL의 확산의 정도를 정량화 할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 부피는 nodose 신경절 주입 용액의 광범위한 확산을 보장하기 위해 선택되었다. 기타 유사한 프로토콜에 따라 볼륨이 너무 차이가 없었다 주입 0.1 ~ 3 μL에서였다. 8,9,14-16 오일 dronabinol의 확산의 정도는 5-HT에 의한 무호흡증 감쇠하기에 충분했다. (17) 이 프로토콜에 대한 수정이 가능합니다. nodose 신경 손상의 예방 필요성, 작은 게이지 바늘 (최소 33 G) 인 경우 첫째,이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 작은 GAU를 사용하는 단점GE의 바늘 : 1) 그들은 쉽게 부서 지거나 구부러 될 수있다 2) 이들은 내경은 참기름과 같은 점성 유체의 주입을 허용하기에는 너무 작다. 깊이 사이트 주입이 중요한 경우 또한, (45 °까지) 더 수직 각도 바늘을 구입하실 수 있습니다. 그러나, 더 수직의 각도는 더 어려워 nodose 신경절을 천공하도록 만들 것이다. nodose 신경절 주입 중에 미주 신경의 수정 장력은 다양한 크기의 마이크로 클램프를 배치함으로써 변경 될 수있다. 미주 신경 / nodose 신경 손상 후 작은 마이크로 클램프를 이용하여 방지 할 필요가있는 경우에 이상적이다. 마지막으로, 신경 화학 물질을 포함하는 유체의 주입은 볼륨과 유체의 농도 주입을 통해 수정 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 5 μl의 nodose 신경을 포화시키기에 충분했다. 이 프로토콜의 주요한 제한 nodose 신경절 통해 천공의 가능성이다. 이 경우, 다음 nodose 신경절 SHO의 무결성을 재 - 확인자민련은 할 수. nodose 신경절의 무결성이 확인되면, nodose 신경절 주입 반복 될 수있다. 의심 nodose 신경절에 대한 무결성이있는 경우에는, 새로운 다음 쥐 실험이 완료되어야한다. (17) nodose 신경절에 수용체의 다양성은 증가 또는 구 심성 신경 활성을 억제 할 수있다. 증가 증거는 구 심성은 결코 활동이 인간의 질병에 중요한 역할을 없음을 의미한다. 2-4,23이 프로토콜은 구 심성 신경 활동에 미치는 영향을 연구하기 위해 nodose 신경절에 신경 화학 물질의 지방 행정의 저렴한 방법을 제공한다.

Afferent signaling via the vagus nerve (cranial nerve X) transmits important general visceral information to the central nervous system (CNS) from baro-, chemo-, hepatic osmo-, cardiac, pulmonary, and gastric receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract (NTS) of the medulla. The cell bodies of the pseudounipolar neurons of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority is found in the former. Nodose ganglion cells contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that when activated, can modify afferent vagus nerve activity.1 Numerous innervations of the afferent vagus nerves coupled with the diversity of receptors located on the nodose ganglia illustrate the biological importance of this cranial nerve, and systemic drugs that do not cross into the CNS targeted at receptors on nodose ganglia can be used to treat various diseases, such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough.2-4
The ease of access to the nodose ganglia lends itself to experimental manipulation by midline longitudinal incision made at the neck. The vagus nerve emerges from the posterior lacerated foramen at the base of the skull, and immediately displays a swelling of the nerve that is the nodose ganglion. The nodose ganglion is easily recognizable due to two nerve branches that arise from it: anteriorly the pharyngeal branch; and posteriorly superior laryngeal branch.5 Previous experimental manipulations of the nodose ganglia involved electrophysiological recordings,6 injections of immunohistochemical or immunofluorescent compounds for nerve tracings,7-10 superfusion or injections of neuroexcitotoxins,11-13 injections of adeno-associated virus to knockdown receptors,14,15 and injections of receptor-specific neurochemicals to change the activity of the vagus nerve.16,17
Systemic injections of neurochemicals are problematic in that systemic treatment affects both peripheral and central nervous systems. Thus, systemic treatment does not isolate the effect of neurochemicals on afferent vagal nerve activity. This protocol describes a method using readily available equipment of intranodose injections in the Sprague-Dawley rat that modulates vagus nerve activity without affecting the central nervous system. Stimulation of serotonin type 3 (5-HT3) receptors on nodose ganglia by intravenous (IV) infusion of serotonin (5-HT) induces the Bezold-Jarisch reflex, a vagal response trifecta of bradycardia, hypotension, and apnea, which can be abolished by supranodose vagatomy.11,17-19 Apnea is easily measured by placing a respiratory transducer around the abdomen of the rat.17,18 Cannabinoids decrease 5-HT-induced current in nodose ganglia cells,20 and intranodose ganglia injections of dronabinol attenuate 5-HT-induced apnea.

<table><tbody><tr><td>5-HT HCl</td><td>MP Biomedicals</td><td>215376591</td><td>12.5 &amp;micro;g/kg per 350 &amp;micro;l/kg</td></tr><tr><td>Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 &amp;micro;g/&amp;micro;l)</td><td>AbbVie</td><td>NDC 0051-0023-21</td><td>Dilute with sesame oil to 20 &amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Sesame Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Polyethylene-50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Ordered from VWR (Cat. # 63019-047)</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5138</td><td>Two are needed</td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7441</td><td>Three are needed</td></tr><tr><td>Piezoelectric Strain Gauge</td><td>Ambu</td><td>813255-100</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition USB Subsystems</td><td>DataWave Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sciworks Experimenter Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyberAmp</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 500 &amp;micro;l, Model 1750 TLL</td><td>Hamilton Company</td><td>81220</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 &amp;micro;l, Model 1801 RN</td><td>7659-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle, 28 G, Small Hub RN</td><td>7803-02</td><td>Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in</td><td></td></tr></tbody></table>

a method of nodose ganglia injection in sprague-dawley rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

그림 1은 dronabinol의 intranodose 신경 주사 전후에 가사를 유도하는 5-HT의 주입했다 쥐에서 샘플 호흡 녹화를 나타냅니다. 5-HT는 5-HT에게 서맥, 저혈압, 무호흡의 Bezold-Jarisch 반사에 기여하는 nodose 신경절에 3 수용체를 활성화합니다. dronabinol의 11,17-19 Intranodose 신경 주사는 억제 CB 수용체를 활성화 또는 알로 스테 릭 5-HT는 변조 (그림 1, 상단 패널) 전후 미주 신경의. 16,17,20,22 5-HT에 의한 자극을 억제하는 3 수용체 (그림 1, 가운데 패널) 5-HT의 목 수술 주입 (그림 1 ) 붉은 선으로 기소 압전 스트레인 게이지에 의해 측정 복부 운동의 부족으로 볼 apneic 반응을 이끌어 낸다. dronabinol의 intranodose 신경 주사 (그림 1, 하단 패널) 한 후, IV 5-HT의 주입은 유도하지 않았다apneic 응답. 차량 제어 래트 nodose 신경절에 참기름 주사 (데이터는 도시하지 않음) 후, 5-HT IV 주입은 기준선 비교 apneic 응답을 이끌어. 17 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52233/52233fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. 이전과 미주 신경의 nodose 신경절에 100 μg의 dronabinol 5 μL 참기름 주사 후 급성 5-HT-indudced 무호흡증 실험에서 샘플 녹음이 17 호흡기 기록은 수술 후, 수술 (상단 패널) 전에 찍은 ( 가운데 패널) 및 nodose 신경 주사 후 (아래 패널). 레드 라인은 무호흡을 유도 IV 5-HT 주입을 의미합니다. 차량 제어 래트 nodose 신경절에 참기름 주사 (데이터는 도시하지 않음) 후, IV 5-HT의 주입 기준선 비교 apneic 응답을 이끌어. (17)이 도면은 Calik 외에서 개질되었다. 17AU = 임의의 단위; RESP = 호흡.

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A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

스프 라그 - 돌리 쥐에 Nodose 신경절 주입하는 방법

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K 조회수.  University of Illinois at Chicago. Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

비디오: A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

연구

행동분석학

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy 허리 지 루트 신경 절의 액세스 및 돼지에 주입

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

신경과학

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons ...

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into sympathetic and parasympathetic branches. Normally, there is a balance between these two branches to maintain homeostasis. However, cardiac disease states such as myocardial infarction, heart failure, and hypertension can induce the remodeling of cells involved in cardiac innervation, which is associated with an adverse clinical outcome.
Although there are vast amounts of data for the histological structure and function of the cardiac autonomic nervous system, its molecular biological architecture in health and disease is still enigmatic in many aspects. Novel technologies such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) hold promise for the genetic characterization of tissues at single-cell resolution. However, the relatively large size of neurons may impede the standardized use of these techniques. Here, this protocol exploits droplet-based single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq), a method to characterize the biological architecture of cardiac sympathetic neurons in health and disease. A stepwise approach is demonstrated to perform snRNA-seq of the bilateral superior cervical (SCG) and stellate ganglia (StG) dissected from adult mice.
This method enables long-term sample preservation, maintaining an adequate RNA quality when samples from multiple individuals/experiments cannot be collected all at once within a short period of time. Barcoding the nuclei with hashtag oligos (HTOs) enables demultiplexing and the trace-back of distinct ganglionic samples post sequencing. Subsequent analyses revealed successful nuclei capture of neuronal, satellite glial, and endothelial cells of the sympathetic ganglia, as validated by snRNA-seq. In summary, this protocol provides a stepwise approach for snRNA-seq of sympathetic extrinsic cardiac ganglia, a method that has the potential for broader application in studies of the innervation of other organs and tissues.

This protocol describes the detailed, low-input sample preparation for single-nucleus sequencing, including the dissection of mouse superior cervical and stellate ganglia, cell dissociation, cryopreservation, nucleus isolation, and hashtag barcoding.

단일 핵 RNA 시퀀싱을 위한 마우스 교감신경 신경절의 바코드된 항체를 사용한 저입력 핵 분리 및 멀티플렉싱

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

의학

신경 줄기 및 희소돌기아교세포 전구 세포 분리를 위한 쥐 "뇌 착유"

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

저자 스포트라이트: Collecting Neural Stem and Progenitor Cells from Live Animals Using a Novel Brain Milking Protocol (새로운 뇌 착유 프로토콜을 사용하여 살아있는 동물에서 신경 줄기 및 전구 세포 수집) 

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

Direct Vagus Nerve Injection Protocol For Rats

There is a relative abundance of strategies and methodologies to facilitate drug delivery to the central nervous system. However, drug delivery directly to the peripheral nervous system is less common, with fewer detailed methods publications available to aid researchers. Here, we describe a direct nerve injection method for peripheral nervous system drug delivery, using the vagus nerve as a model nerve. This method can be used in the treatment of autonomic nervous system disorders through targeting of the left vagus nerve, although this general injection method can be extrapolated to injection of other nerves with minor modification. This method explains all critical steps involved in the procedure involving microsurgery in anesthetized adult rats under a dissecting microscope. The use of a tracking dye is described to facilitate the monitoring of injection fidelity in real time. Illustrations of successful and failed injections are provided. If carried out properly, direct vagus nerve injections can be conducted in a safe manner that is well-tolerated by the rat without post-delivery complications. For example, once the surgeons were trained in this method, six out of six rats were successfully injected without any complications. This method of direct nerve injection for preclinical rat studies is capable of delivering agents (including but not limited to gene therapy) to peripheral nerves.

We present a protocol for direct vagus nerve injection in rats, enabling drug delivery directly into the nerve without post-injection complications. This method applies to preclinical neurological studies involving autonomic nervous system manipulation. It can be used for direct nerve injection for other nerves in rats and other species, with necessary modifications.

쥐를 위한 직접 미주신경 주사 프로토콜

There is a relative abundance of strategies and methodologies to facilitate drug delivery to the central nervous system. However, drug delivery directly ...

스프 라그 - 돌리 쥐에 Nodose 신경절 주입하는 방법

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Laminotomy 허리 지 루트 신경 절의 액세스 및 돼지에 주입

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Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

단일 핵 RNA 시퀀싱을 위한 마우스 교감신경 신경절의 바코드된 항체를 사용한 저입력 핵 분리 및 멀티플렉싱

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

쥐를 위한 직접 미주신경 주사 프로토콜