Diese Studie wurde vom National Institutes of Health (Grants 1UM1HL112856) unterstützt.

Alle Verfahren und Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Illinois in Chicago genehmigt. Hier beschriebenen Experimente sind akute nicht-Überlebensversuchen, und es gab keine Verwendung von Augensalbe. Aufrechterhaltung steriler Bedingungen nur auftritt, wenn chirurgische Instrumente mit 70% Ethanol in DiH 2 O gewaschen Opferung Ratten am Ende des Experiments erfolgte durch Überdosierung von IV Ketamin / Xylazin. 1. Vorbereitung der Instrumente und Chemikalien <ol><li> Bereiten Stammlösung von 0,05 M 5-HT-HCl in PBS. Dann verdünnt Lager mit PBS zu einer endgültigen 5-HT-Konzentration von 0,203 mM. </li><li> Verdünne Dronabinol in Sesamöl in einer Konzentration von 20 ug / ul. </li><li> Schneiden 20 cm Länge aus Polyethylen (PE) -50-Schlauch (0,58 mm ID, OD 0,965 mm). An einem Ende des Schlauches, schneiden eine Schräge Spitze mit einer Schere, und am anderen Ende Platz, legen Sie eine 23 g Nadel. Verbinden Sie diese 23 g Nadel in einen 1 mlSpritze und füllen Sie es mit 0,3 ml von 50 U / ml Heparin. </li><li> Schneiden Sie vier Stücke von 4-0 geflochtenen Seidenfaden und zur Seite gesetzt. </li><li> Sterilisieren chirurgischer Scheren, 2 gekrümmt Graefe Pinzette und 3 Mikroschellen mit 70% Ethanol in DIH 2 O. </li></ol> 2. Katheterisierung der Oberschenkelvene Protokoll zur Katheterisierung von Jespersen et al modifiziert. 21 <ol><li> Anesthetize eine Sprague-Dawley-Ratte mit intraperitoneale (IP) Ketamin / Xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg). Drücken Sie den Fuß von der Ratte und beobachten jede Bewegung, um ein angemessenes Niveau der Anästhesie zu bestätigen. Rasieren Sie die ventralen Seite des linken Oberschenkels und der ventralen Seite des Halses. Wenn von der lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Bedarf wenden Sie Augensalbe zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Sichere Ratte in Rückenlage auf einer chirurgischen Bord. Verwenden chirurgische Schere in die linke Hinterschenkel wegschneiden Haut. </li><li> Mit einer Pinzette, Verhalten stumpfen DISSECTIOn der oberflächlichen Muskeln, um die Vena femoralis freizulegen. Verwenden Sie die Pinzette, um die Vene aus der Oberschenkelarterie auf der Vena femoralis zu trennen, und legen Sie zwei Threads. </li><li> Verwenden Sie die Pinzette gebogen Graefe Pull-up die Vene um den Blutfluss zu stoppen. Mit einem 22 G Injektionsnadel, Punktion der Vena femoralis und legen Sie die abgeschrägte Ende des PE-50-Schlauch in die Vene. </li><li> Prüfen, ob das PE-Schlauch 50 vollständig durch Zurückziehen des Kolbens der Spritze eingesetzt wurde. Blut sollte gesehen in die PE-50-Schlauch werden. Binden Sie 2 Knoten um die Vene und PE-50-Schlauch mit den zwei Themen. </li></ol> 3. 5-HT-induzierte Apnoe durch IV-Infusion <ol><li> Legen Sie eine piezoelektrische Dehnungsmessstreifen auf der Ratte, um die Atmung zu messen. </li><li> Ändern der Einstellungen für Verstärkung Ebene der elektronischen Verstärker über den Verstärker-Software auf dem Computer: zu verstärken (100x) und Bandpassfilter (1-10 Hz) die Atemsignale von der DMS erhalten, setzen Sie &quot;Hochpassfilter&quot; auf &amp; #8220; AC @ 1 HZ &quot;und&quot; Tiefpassfilter &quot;auf&quot; 10 Hz &quot;, und stellen Sie die Verstärkung durch die Eingabe von&quot; 10 &quot;für die&quot; Initial Gain &quot;und&quot; 100 &quot;für&quot; Total Gain &quot;.. </li><li> Ändern Sie die Einstellungen für die Abtastrate durch Öffnen &quot;Analog Input&quot; über-Recording-Software auf dem Computer. Zu digitalisieren (500 Hz Abtastrate) mit einem Analog-Digital-Wandler, &quot;Probe&quot; auf &quot;1000 Hz&quot; und &quot;Überspringen&quot; jeden zweiten Aufnahmepunkt von &quot;1&quot; (effektive Abtastrate 500 Hz), und nehmen Sie dann das Signal mit Recording-Software. </li><li> Entfernen Sie die 1-ml-Spritze aus dem Katheter und legen Sie eine 500 ul Präzisionsglasspritze mit 0,203 mM 5-HT gefüllt in den Katheter. </li><li> Legen Sie die 500 ul Präzisionsglasspritze in einer Infusionspumpe. Infundieren 12,5 ug / kg pro 350 ul / kg 5-HT-Lösung mit einer Rate von 63 ml / Std. Führen Sie mehrere Infusionen und beobachten Apnoe bei Ratte, was gesehen wird einsa in Atmung (≥ 2,5 s) in den aufgezeichneten Atemsignale auf dem Computermonitor anzuhalten. </li><li> Bevor mit Hals-Chirurgie fortfahren, überwachen die Atmung Muster und überprüfen Sie die Schmerzreflex von der Zehe Prise bei der Ratte. Bei unregelmäßiger Atmung oder, wenn es eine Schmerzreflex von der Zehe Prise, zu verwalten IP Ketamin / Xylazin (100 mg / kg: 5 mg / kg) und dann erneut bestätigen eine angemessene Gabe von Betäubungsmitteln. </li></ol> 4. Hals-Chirurgie zu nodose Ganglia Expose <ol><li> Sichere Ratte in Rückenlage auf einer chirurgischen Bord. Machen Sie eine Mittellinie Längsschnitt mit chirurgische Schere am Hals. </li><li> Mit stumpf auf dem Platysma (mit 2 Mikroklemmen, diese Muskel klar von der Operationsstelle zu halten), setzen die sternohyoideus und omohyoideus Muskeln. Trennen Sie die Muskeln um die innere Halsschlagader und einer ihrer Geschäftsstellen, die pterygopalatina Arterie freizulegen. </li><li> Beachten Sie den Vagusnerv, wie es läuft entlang der A. carotis interna und dann entlang th<html> e pterygopalatina Arterie. Beobachten Sie, wie die Vagusnerv und pterygopalatina Arterie, zusammen mit dem N. glossopharyngeus (Hirnnerven IX) und der N. accessorius (Hirnnerv XI), geben Sie die hintere zerrissen Foramen an der Basis des Schädels. </li><li> Beachten Sie, dass das Ganglion nodosum als Schwellung der Vagusnerv rechts, bevor es die Hinter zerrissen Foramen tritt angezeigt. Beachten Sie auch, dass die Rachen- und Kehlkopfnervenäste kommen von den vorderen und hinteren Aspekte bzw. des Ganglion nodosum. 5 </li><li> Mit den Graefe Pinzette, trennen Sie den Vagusnerv von den Arterien, und legen Sie ein Stück Faden um den Vagusnerv. Legen Sie eine Klemme auf dem Thread, um leichte Spannung auf den Vagusnerv gelten, und reinigen Sie die Ganglion nodosum aller Bindegewebe auf weniger Widerstand bieten, wenn die Injektion. </li><li> Wiederholen Sie die 5-HT-induzierte Apnoe, wie in Abschnitt 3 angegeben, um zu bestätigen, dass kein Schaden an den Ganglien nodosum getan. </li></ol>itel &quot;&gt; 5. Intranodose Ganglia Injektion von Dronabinol <ol><li> Füllen Sie eine 10 &amp; mgr; gasPräzisionsGlasSpritze mit einem maßgeschneiderten 28 g Halbzoll-Spritzennadel mit einer 35 ° abgeschrägten Spitze mit 5 ul von Dronabinol in Sesamöl versehen. </li><li> Legen Sie eine Mikroklemme am Faden leichter Spannung auf den Vagusnerv anwenden und durchbohren die Ganglion nodosum dabei nicht zu durchbohren. Drücken Sie den Spritzen langsam (≥ 60 sec), um den gesamten Inhalt der Spritze zu injizieren. Beachten Sie, dass einige der Spritzeninhalt wird aus dem Ganglion austreten. </li><li> Wiederholen Sie die 5-HT-induzierte Apnoe, wie in Kapitel 3 angegeben. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche Injektion von Neurochemikalien in den Ganglien nodosum sind: 1) die Identifizierung und Reinigung des Bindegewebes an der Ganglien nodosum; 2) Bestätigung der Integrität der nodose Ganglien vor Injektion; 3) und unter Verwendung einer kleinen Nadel, um fein zu injizieren, aber nicht vollständig durch Punktierung nodosum ganglia. Der Vagusnerv innerviert viele Organe in den Hals und Bauch, und gibt wichtige Informationen wie Herzfrequenz, Blutdruck, bronchopulmonale Reizung, und Magen-Spannungsgefühl an das ZNS. Die Ganglien nodosum des Vagus enthalten eine Vielfalt von Rezeptoren für Aminosäuren, Monoamine, Neuropeptide und andere Neurochemikalien. 1 Intranodose Ganglien Injektionen von Neurochemikalien für jene Rezeptoren, um die Aktivität des Nervus vagus ändern vorher getan haben, wurden 16,17 und stellen ein hervorragendes Versuchsmodell zu Peripherie pharmacologi aufzuklärencal Auswirkungen auf den Vagusnerv, die Krankheiten wie Schlafapnoe, gastroösophageale Refluxkrankheit, chronischer Husten oder ändern kann. 2-4 Um die Ganglien nodosum ausgesetzt wird Hals-Chirurgie durchgeführt und Nackenmuskulatur werden getrennt, um die innere Halsschlag aussetzen. Die vagus gesehen entlang der A. carotis interna und der pterygopalatina Arterien läuft. Die Zellkörper der unipolaren vagus sind im nodose und Felsenganglien, die als Quellen der vagus vor dem Eintritt in den Schädel an den hinteren zerrissen Foramina gesehen befinden. 5 Manipulationen der nodose Ganglien sind insofern von Bedeutung, dass die Knoten-Ganglien und vagus nicht während der Operation beschädigt. Unsachgemäße und roh Operationstechnik können die Ganglien nodosum und seine Nervenäste, zusammen mit den Arterien und anderen Hirnnerven schädigen. In diesem Protokoll, um den Vagusnerv stabilisieren, bieten wir eine leichte Spannung auf die Vagus Nerven über Seidenfaden an einen Mikroclip befestigt. Dies ermöglicht uns, jeden Bindegewebe, machen es schwieriger, in das Ganglion nodosum injizieren könnte ausreichend zu reinigen. Außerdem bestätigen wir, dass die Knoten-Ganglien intakt, bevor mit der Injektion verläuft durch Induktion Apnoe durch 5-HT-Infusion sind. Um in das Ganglion nodosum injizieren, haben wir kostengünstige Kleinanzeige (28 G, OD 362 um) Nadeln zu einem KPG-Spritze befestigt. Da der Injektionsstelle Tiefe Stechen durch die Ganglien nodosum abwenden konnte ein Anliegen, die abgeschrägten Spitzen der Spritzen wurden Brauch mit einer vertikalen Winkel von 35 ° hergestellt. Dies unterscheidet sich von anderen Mikroinjektion Techniken, bei denen Glasmikropipetten verwendet werden 8-10,14-16 Der Vorteil der Glasmikropipetten ist eine kleinere Spitzendurchmesser. jedoch besteht die Gefahr des Brechens der Spitze während des Verfahrens aufgrund der Zerbrechlichkeit des Glases. Darüber hinaus ist eine teure Ausrüstung erforderlich, um die Glas-Mikropipette, die nicht jedes Labor besitzen können, ziehen. Maßgeschneiderte Nadeln haben keine Bruchgefahr, und obwohl sie von größerem Durchmesser (362 um) 17 im Vergleich zu Glasmikropipetten (20-100 ul) wurden 8,9,14-16 die Nadeln noch klein genug für nodose Ganglien Injektionen. Darüber hinaus waren diese Nadeln wiederverwendbare für viele Experimente und waren erheblich weniger Kosten als Anlagen, die zur Mikropipetten zu ziehen. Aufgrund der Größe der benutzerdefinierten Adeln zur Injektion in nodose ganglia verwendet wird, ist es wichtig, zu Schaden zu beurteilen, wenn überhaupt, auf die Knoten-Ganglien. Eine Methode zur Bewertung der Beschädigung der nodose ganglia ist durch histologische Verarbeitung und Mikroskopie nodosum ganglia. 6-9,13,15 Eine zweite Methode, die in diesem Protokoll verwendet wird, um vagalen afferenten Funktion beurteilen vergleicht elektro oder Verhaltensergebnisse zwischen Versuchs- und Kontrollgruppen Injektion. 14-17 Dronabinol Injektionen wurde gezeigt, dass 5-HT-induzierter Apnoe dämpfen Vergleich zu control Injektionen, 17 was bedeutet, dass, wenn es einige Schäden aus den größeren Durchmesser benutzerdefinierte Nadeln gab es noch genügend funktions nodose Ganglienzellen, die von Dronabinol gehemmt wurden. Ähnlich Quantifizieren des Ausmaßes der Diffusion des 5 ul Dronabinol in Öl ist nicht notwendig, da der funktionellen Fähigkeiten (dh Apnoe) waren die wichtige Metrik dieses Protokolls. Der in diesem Protokoll verwendete Volumen wurde gewählt, um die weite Verbreitung der in den Ganglien nodosum injizierten Lösung zu garantieren. In anderen ähnlichen Protokollen injizierten Volumina waren nicht übermßig unterschiedlich und lag im Bereich von 0,1 bis 3 &amp; mgr; l. 8,9,14-16 Das Ausmaß der Diffusion von Dronabinol Öl ausreichend war, um 5-HT-induzierter Apnoe dämpfen. 17 Änderungen an diesem Protokoll sind möglich. Erstens, wenn die Schadensprävention an den Ganglien nodosum ist eine Notwendigkeit, kleinere Gauge-Nadeln (kleinste 33 G) kann in diesem Protokoll verwendet werden. Der Nachteil bei der Verwendung einer kleineren Gauge Nadeln ist: 1) sie leicht gebrochen oder verbogen werden; 2) sie den Innendurchmesser zu klein ist, um die Injektion von viskosen Flüssigkeiten wie Sesamöl ermöglichen. Außerdem, wenn Tiefen Website Injektion erforderlich ist, können mehrere vertikale Winkel Nadeln (bis zu 45 °) bezogen werden. Jedoch wird eine weitere Vertikalwinkel machen es schwieriger, die Knoten-Ganglien stechen. Beim Einspritzen des nodose Ganglien können modifiziert Spannung des Nervus vagus, indem Mikroschellen unterschiedlicher Größe verändert werden. Wenn eine Beschädigung des Nervus vagus / nodose Ganglien verhindert werden soll, dann mit kleineren Mikroklemmen ist ideal. Schließlich kann die Injektion von Flüssigkeiten, die Neurochemikalien über Volumen und die Konzentration der Flüssigkeit injiziert modifiziert werden. Bei diesem Protokoll war 5 &amp; mgr; l mehr als genug, um die Knoten-Ganglien zu sättigen. Eine Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist die Möglichkeit des Durchstechens durch die Knoten-Ganglien. Wenn dies geschieht, dann erneut die Bestätigung der Integrität der nodose ganglia should erfolgen. Wenn die Integrität des nodose ganglia wird bestätigt, dann nodose ganglia Injektion kann wiederholt werden. Allerdings, wenn es Zweifel an der Integrität des nodose Ganglien, dann ein Experiment mit einem neuen Ratten abgeschlossen sein soll. 17 Die Vielfalt der Rezeptoren auf der Ganglien nodosum kann vermehrt oder gehemmt afferenten Nervenaktivität. Zunehmende Hinweise darauf, dass afferente nie Aktivität spielt eine wichtige Rolle in der menschlichen Krankheiten. 2-4,23 Dieses Protokoll stellt ein kostengünstiges Verfahren der lokalen Verwaltung von Neurochemikalien in die Ganglien nodosum, um ihre Auswirkungen auf die afferenten Nervenaktivität zu untersuchen.

Afferent signaling via the vagus nerve (cranial nerve X) transmits important general visceral information to the central nervous system (CNS) from baro-, chemo-, hepatic osmo-, cardiac, pulmonary, and gastric receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract (NTS) of the medulla. The cell bodies of the pseudounipolar neurons of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority is found in the former. Nodose ganglion cells contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that when activated, can modify afferent vagus nerve activity.1 Numerous innervations of the afferent vagus nerves coupled with the diversity of receptors located on the nodose ganglia illustrate the biological importance of this cranial nerve, and systemic drugs that do not cross into the CNS targeted at receptors on nodose ganglia can be used to treat various diseases, such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough.2-4
The ease of access to the nodose ganglia lends itself to experimental manipulation by midline longitudinal incision made at the neck. The vagus nerve emerges from the posterior lacerated foramen at the base of the skull, and immediately displays a swelling of the nerve that is the nodose ganglion. The nodose ganglion is easily recognizable due to two nerve branches that arise from it: anteriorly the pharyngeal branch; and posteriorly superior laryngeal branch.5 Previous experimental manipulations of the nodose ganglia involved electrophysiological recordings,6 injections of immunohistochemical or immunofluorescent compounds for nerve tracings,7-10 superfusion or injections of neuroexcitotoxins,11-13 injections of adeno-associated virus to knockdown receptors,14,15 and injections of receptor-specific neurochemicals to change the activity of the vagus nerve.16,17
Systemic injections of neurochemicals are problematic in that systemic treatment affects both peripheral and central nervous systems. Thus, systemic treatment does not isolate the effect of neurochemicals on afferent vagal nerve activity. This protocol describes a method using readily available equipment of intranodose injections in the Sprague-Dawley rat that modulates vagus nerve activity without affecting the central nervous system. Stimulation of serotonin type 3 (5-HT3) receptors on nodose ganglia by intravenous (IV) infusion of serotonin (5-HT) induces the Bezold-Jarisch reflex, a vagal response trifecta of bradycardia, hypotension, and apnea, which can be abolished by supranodose vagatomy.11,17-19 Apnea is easily measured by placing a respiratory transducer around the abdomen of the rat.17,18 Cannabinoids decrease 5-HT-induced current in nodose ganglia cells,20 and intranodose ganglia injections of dronabinol attenuate 5-HT-induced apnea.

<table><tbody><tr><td>5-HT HCl</td><td>MP Biomedicals</td><td>215376591</td><td>12.5 &amp;micro;g/kg per 350 &amp;micro;l/kg</td></tr><tr><td>Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 &amp;micro;g/&amp;micro;l)</td><td>AbbVie</td><td>NDC 0051-0023-21</td><td>Dilute with sesame oil to 20 &amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Sesame Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Polyethylene-50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Ordered from VWR (Cat. # 63019-047)</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5138</td><td>Two are needed</td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7441</td><td>Three are needed</td></tr><tr><td>Piezoelectric Strain Gauge</td><td>Ambu</td><td>813255-100</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition USB Subsystems</td><td>DataWave Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sciworks Experimenter Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyberAmp</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 500 &amp;micro;l, Model 1750 TLL</td><td>Hamilton Company</td><td>81220</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 10 &amp;micro;l, Model 1801 RN</td><td>7659-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle, 28 G, Small Hub RN</td><td>7803-02</td><td>Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in</td><td></td></tr></tbody></table>

a method of nodose ganglia injection in sprague-dawley rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

1 stellt Probenatmungsaufzeichnungs in Ratten, die Infusion von 5-HT-Apnoe vor und nach intranodose ganglia Injektionen von Dronabinol induziert hatte. 5-HT aktiviert 5-HT 3 -Rezeptoren auf der Knoten-Ganglien, die mit dem Bezold-Jarisch-Reflex Bradykardie, Hypotonie und Apnoe beitragen. 11,17-19 Intranodose ganglia Injektionen von Dronabinol aktivieren inhibitorische CB Rezeptoren oder allosterisch moduliert 5-HT 3 Rezeptoren, die die 5-HT-induzierte Anregung der Vagusnerv. 16,17,20,22 vor (Abbildung 1, oberes Feld) und nach zu hemmen (Abbildung 1, Mitte) Hals-Chirurgie Infusion von 5-HT (Bild 1 durch rote Linie angeklagt) löst eine Apnoe Reaktion als ein Mangel an Bauch Bewegung durch das piezoelektrische Dehnungsmessstreifen gemessen gesehen. Nach intranodose Ganglien Injektionen von Dronabinol (Abbildung 1, unteres Feld), habe IV 5-HT-Infusion nicht zu entlockeneine Apnoe Antwort. Nach Sesamöl-Injektionen (Daten nicht gezeigt) in nodose Ganglien des Fahrzeugkontrollratten, IV 5-HT Infusions löste eine Apnoe-Reaktion vergleichbar mit Basislinien. 17 <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52233/52233fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Beispiel-Aufnahmen von akuten 5-HT-indudced Apnoe Experimente vor und nach 100 ug Dronabinol in 5 ul Sesamöl Injektionen in den Ganglien nodosum der vagus 17 Atem Aufnahmen wurden vor der Operation (oben) aufgenommen, nach der Operation ( Mitte), und nach dem Ganglien nodosum Injektionen (unten). Rote Linie bedeutet IV 5-HT-Infusion zu einer Apnoe zu induzieren. Nach Sesamöl-Injektionen (Daten nicht gezeigt) in nodose Ganglien des Fahrzeugkontrollratten, IV 5-HT Infusions löste eine Apnoe-Reaktion vergleichbar mit Basislinien. 17 Diese Zahl hat sich von Calik et al geändert wurde. 17AU = willkürlichen Einheiten; RESP = Atemwege.

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A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

Eine Methode der Ganglien nodosum Injection in Sprague-Dawley-Ratte

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

Serie: A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Minimal-invasive Technik für die Injektion in Ratten-Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomie LWS Dorsal Root Ganglion-Zugriff und Injektion bei Schweinen

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Verabreichung von AAV9 durch Lumbalpunktion bei juvenilen Ratten für die ZNS-Gentherapie

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

Autor im Rampenlicht: Bewertung der Wirksamkeit der intrathekalen Gentherapie bei juvenilen Ratten

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

Direct Vagus Nerve Injection Protocol For Rats

There is a relative abundance of strategies and methodologies to facilitate drug delivery to the central nervous system. However, drug delivery directly to the peripheral nervous system is less common, with fewer detailed methods publications available to aid researchers. Here, we describe a direct nerve injection method for peripheral nervous system drug delivery, using the vagus nerve as a model nerve. This method can be used in the treatment of autonomic nervous system disorders through targeting of the left vagus nerve, although this general injection method can be extrapolated to injection of other nerves with minor modification. This method explains all critical steps involved in the procedure involving microsurgery in anesthetized adult rats under a dissecting microscope. The use of a tracking dye is described to facilitate the monitoring of injection fidelity in real time. Illustrations of successful and failed injections are provided. If carried out properly, direct vagus nerve injections can be conducted in a safe manner that is well-tolerated by the rat without post-delivery complications. For example, once the surgeons were trained in this method, six out of six rats were successfully injected without any complications. This method of direct nerve injection for preclinical rat studies is capable of delivering agents (including but not limited to gene therapy) to peripheral nerves.

We present a protocol for direct vagus nerve injection in rats, enabling drug delivery directly into the nerve without post-injection complications. This method applies to preclinical neurological studies involving autonomic nervous system manipulation. It can be used for direct nerve injection for other nerves in rats and other species, with necessary modifications.

Direktes Vagusnerv-Injektionsprotokoll für Ratten

There is a relative abundance of strategies and methodologies to facilitate drug delivery to the central nervous system. However, drug delivery directly ...

Lumbar Intrathecal Injection of Gene Therapy Vectors for Central Nervous System Targeting in Mice and Rats

One method to target the central nervous system for treating neurological diseases involves utilizing the lumbar intrathecal route of administration. This approach bypasses the blood-brain barrier to directly access the cerebrospinal fluid and preferentially target cells within the central nervous system. Multiple published preclinical studies employing the lumbar intrathecal injection route have contributed to the development of gene therapy clinical trials; however, the described protocols are variable and dispersed across multiple resources. Here, a comprehensive set of protocols for lumbar intrathecal injections in neonatal, juvenile, and adult mice and rats for preclinical gene therapy studies is presented. With proper training, this injection technique can be performed quickly and reliably. In addition to detailing the injection protocol at each developmental stage, associated parameters, such as injection volume, that can influence study outcomes are discussed. To demonstrate the application of lumbar intrathecal injections for targeting the central nervous system, the expression of adeno-associated virus serotype 9 in the brain, spinal cord, and peripheral tissues is presented following a successful or unsuccessful injection.

A lumbar intrathecal injection represents a translationally relevant route of administration for delivering gene therapy to the central nervous system. This comprehensive standardized protocol for lumbar intrathecal injections in neonatal, juvenile, and adult mice and rats aims to guide researchers in adopting this technique for preclinical gene therapy studies.

Lumbale intrathekale Injektion von Gentherapie-Vektoren für das Targeting des Zentralnervensystems bei Mäusen und Ratten

One method to target the central nervous system for treating neurological diseases involves utilizing the lumbar intrathecal route of administration. This ...

Eine Methode der Ganglien nodosum Injection in Sprague-Dawley-Ratte

Zusammenfassung

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Intrathekale Vektorverabreichung bei juvenilen Ratten über die Injektion in die Lendenwirbelsäule

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