Name: high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization at JoVE.com

The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

참고 : 우리의 이전에 출판 된 작품 (12)에서 사용이 프로토콜은 식균 작용과 액틴의 중합 정량 등의 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 다양한 변형라는 것으로하고, 표 1 세포 유형과 입자를 성공적으로 과거의 연구에 활용. 식균 작용 또는 액틴의 중합 정량이 프로토콜의 표준 사용은 그림 1에 예시되어있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> 그림 1 :. 세포, 도금 처리하고 준수하도록 허용 한 후 다이어그램은 식균 작용과 액틴의 중합 정량 형광 분석의 녹색 형광 (FITC)로 표지 입자가 식균 작용에 대한 세포에 추가됩니다. 반응은 트리 판 또는 antibi에 의해 정지귀 세척 (비 내재화 입자를 제거하기 위해)과의 고정은 4 % 파라 포름 알데하이드를 행한다. 세포는 이후 적색 형광 굴지의 레이블 (로다 민 팔로이 딘), 청색 형광 라벨 (DAPI)로 염색한다. 식균 작용과 액틴의 중합 인덱스는 녹색 / 청색 (FITC / DAPI), 또는 레드 / 블루 (로다 민 / DAPI) 형광의 상대 형광 단위의 비율로 정량화. 1. 도금 및 치료 세포 참고 : 시작하기 전에, 플레이트 레이아웃에서 다음 컨트롤을 적어도 4 기술 복제물로 처리를 실행 해보십시오, 여기에는 다음이 포함됩니다 만 입자 세포 만 (단독 DAPI 또는 로다 민 단독으로, 흠). <ol><li> 샘플 오염으로부터 보호하기 위하여 세포 배양 무균 후드 1-4 단계에서 모든 시약 첨가를 실시한다. </li><li> (물론 당) 50 μL에서 1-5 × 10 4 세포에서 96 웰 플레이트에 플레이트 대 식세포 (쥐 J774 세포주)<html> 의 예열 미디어를 보충. 이 방법에 적합 플​​레이트 리더 기능에 따라 취소 또는 검은 색 하의와 블랙 96 웰 플레이트입니다. <ol><li> (탐식 대한 생균을 사용하지 않는 경우)이 보충 미디어 들어 보체 캐스케이드의 간섭을 회피하기 위해 불 활성화 FBS를 10 % 열, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 사용한다. 이용한 부착 세포 접착 1-2 시간, 및 비 - 부착 세포를 허용하는 경우, 500 x g에서 10 분 동안 세포를 스핀 다운 플레이트. </li></ol></li><li> 100 μL (1 배)의 최종 부피 50 μL에 2 배 농도 (보충 미디어,보다 바람직하게는 PBS에 재현 탁 또는)에서 원하는 작용제 / 길항제 또는 차량 제어를 추가하고 원하는 시간 시간 동안 배양한다. 멀티 채널 피펫 및 시약 저수지는 빠른 처리를 촉진 할 것이다. </li></ol> 형광 입자의 2 옵 소닌 ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 표 1 : 테스트 세포 유형과의 형광 분석 형광 입자 탐식 액틴 중합 표 1 세포 유형 조합 (세포주 및 일차 전지)를 도시 우리 그룹 형광 방법을 통해 사용될 것을.. 야생형 세포에 의한 식세포 작용과 액틴의 중합보고 이외에, 우리는 또한 GFP (녹색 형광 단백질)를 발현하는 형질 전환 세포의 탐식의 검사를 위해이 입자의 일부를 사용했다. . 형광 리포터를 함유하는 플라스미드로 형질 세포의 형광도 DAPI 표 범례에 더하여 셀룰러 마커로서 사용될 수있다 : A - 액틴 중합; P - 식균 작용; PT - GFP에 의한 식균 작용은 형질 전환 된 세포를 표지; OPDex - 덱스 트란 비드을 옵 소닌; HKOP - 열이 옵 소닌 죽였다. <ol><li> 형광 입자와 라벨이 항상 빛으로부터 보호되어 있는지, 지속 시간을 확인photobleaching에 방지하기 위해서뿐만 아니라, 배양 중에 처리, 세정을 보내고 <ol><li> 제조업체의 사양을 사용하여, (대장균 K-12 균주 E2861) 건조 입자를 들어, 형광 열 살해 옵 소닌 (HKOP) 박테리아를 달아. 10 확인 질량 계정을 만들주의 : 1 - 20 : 1 박테리아 : 세포의 비율 (또는 적어도 10 : 1의 비율을 - 일반적으로 식균 작용의 정량에 사용) 13, 14. 입자의 수​​는 제조사에 의해 제공 또는 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액의 연속 희석을 couting 통해 결정될 수있다. </li><li> 50 μl의 PBS에 재현 탁하고 가장 높은 설정에서 1 분 소용돌이. 적절한 와동을 (여기 프로토콜에 걸쳐) 입자가 옵 소닌의 효능에 영향을 미칠 수있는 집계 경향이 확인합니다. </li><li> 현탁액에서 입자와 같은 형광 표지 덱스 트란 비드 (DEX 구슬)를 들면, 1 분 동안 와동 원액, 볼륨 D에서 비드 현탁액 또는 농도에 따라 50 μL를 취할한 비드 : 비드 etermine 마운트 (10)를 용이하게하기 위해 셀 비율. </li></ol></li><li> 입자에 opsonizing 시약 같은 부피를 추가하고 적극적으로 다른 분 동안 와동. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 시약으로 opsonizing 입자 인큐베이션. </li><li> 인큐베이션 후, 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리하여 입자를, 과잉 opsonizing 시약을 함유하는 상층 액을 제거한다. PBS 100 ㎕를 첨가하여 입자를 씻어 와류 500 x g에서 5 분간 펠렛을 재현 탁하고 centrifugate한다. <ol><li> 적절한 옵 소닌과 결합되지 않은 항체의 제거를 보장하기 위해 다음 단계를 두 번 반복합니다. </li></ol></li><li> (하나의 96- 웰 플레이트에 충분한) 미디어 5ml에 재현 탁하여 그들 입자의 옵 소닌 작동 용액을 준비하고, 세포에 첨가 할 때까지 빛으로부터 떨어져 저장한다. </li></ol> 3. 탐식 <ol><li> 멸균 시약 저수지 입자의 작업 솔루션을 놓습니다. 여기에서, (50)를 추가56 (50 NG / ㎖의 최종 농도)에 단계 1에서 제조 한 세포로 옵 소닌 L 입자의 식균 작용이 표준 세포 배양 조건에서 발생할 수있다. 이 방법 (도 2)를 사용하여 평가 될 수있다 식균 작용의 두 가지 방법은 다음과 같습니다 그림. </li></ol><img alt="도 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> 도 2 :. 그들은 천천히 우물의 바닥에있는 세포에 도달으로 연속 대 동기화 식균 작용의 비교 연속 식균 작용은 시간이 지남에 따라 입자의 지속적인 국제화를 나타냅니다. 대조 동기화 단계 (원심 분리) 세포와 입자의 접촉을 강화하고, 세포에 의해 즉시 국제화 선도, 바닥에 가라 입자를 강제로. 동기화 식균 작용은보다 신속하게 부품을 내면화 빠른 과정이다입자에 들어갔을 때 : 증가 된 세포에 의한 icles. <ol><li><ol><li> 박테리아가 잘 하단에 도달에 도착하는 그들은 천천히 바닥에 가라 세포와 접촉, 수 있도록 더 긴 시간 프레임을 사용으로 세포가 지속적으로 옵 소닌 세균을 탐식 할 수 있도록 지속적으로 식균 작용 방법 (도 2)의 경우 세포를 터치합니다. timecourse 실험을 실시하는 경우, 상이한 시간 간격에서 박테리아를 추가하고 처리 속도를 향상시키는 동시에 반응의 전체 플레이트를 멈춘다. </li><li> 입자 향상 동기화 탐식 방법 (도 2)의 경우 : 원심 분리를 통해 세포 접촉, 모든 시점의 동기화를 용이하게하기 위해 세포 및 입자 (500 XG에서 5 분) 빨리 입자가 추가를 함유 플레이트 전체를 스핀 다운 세포의 상호 작용 : 입자를 촉진한다. <ol><li> 오른쪽 센트리의 완성 후 시작 시간 경과를 측정fugation 단계. 시간 경과 실험을 실시하면 후술하는 바와 같이, 상이한 시간 간격으로 독립적으로 각 시점을 멈춘다. </li></ol></li></ol></li></ol> 주 : 동기화 탐식 방법은 다소 번잡 이전부터이지만, 짧은 시간에 높은 균성 인덱스를 제공한다. 4. 중지 탐식 <ol><li> 부착 세포의 경우, 상층 액을 제거하고 PBS로 희석 트리 판 블루의 50 μl를 추가 비 내면화 박테리아의 형광을 소화하기 위해, (1 2 희석). </li><li> 비 부착 세포의 경우, 플레이트 스핀 다운 및 뜨는을 제거합니다. 희석 트리 판 블루의 50 μl를 추가합니다. 셀 손실을 최소화하고 충분한 세척을 가능하게하기 위해 각 세척 사이에서 플레이트 (500 XG에 5 ~ 10 분)을 원심 분리하여 확인합니다. </li><li> 트리 판 배양에 따라, (잘 명확 회전에서 PBS를 제거 할 때까지) 잔여 트리 판을 제거하기 위해 PBS로 세포를 두 번 씻는다. TRypan는하지만 살아있는 세균이나 OPDex의 구슬, 형광 표지 비 내면화 열 사망, 세균 입자의 형광 (15, 16)을 해소하는 것으로 나타났다. 살아있는 박테리아를 들어, 페니실린, 스트렙토 마이신 또는 겐타 마이신 대신 비 내면화 입자의 형광의 혼란 효과를 방지하기 위해 트리 판 세척과 같은 항생제와 세척을 포함한다. </li><li> PBS로 세척 한 후, 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎕에 세포를 고정하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다 (각 세척 용 웰 당 100 μL로). 이 단계에서 일주일까지 4 ° C에서 세포를 저장하거나, 염색 및 정량화에 직접 진행합니다. 주 : 모든 후속 단계가이 점 머리말 세포 배양 후드의 외측에 형성 할 수있다. </li><li> 모든 액체를 제거하고 PBS에서 재구성 된 5 ng를 / ㎖에서 DAPI의 50 μl를 추가합니다. 염색 5 분 정도 기다린 다음, PBS로 두 번 세척한다. 세척 단계 후, 각 웰 기록 식균 작용에 PBS의 50 μl를 추가합니다. </lI&gt; </ol> 5. 액틴 염색 주 : 식균 작용에 더하여, 형광 측정 방법은 멜리, pseudopodiae 억제되는 중에 액틴의 강도를 측정하고, 막이 억제제 (도 1A)와 처리의 결과로서 파동 운동하여 액틴 중합 정량화를 가능하게 할 것이다. 이 식균 작용뿐만 아니라 액틴의 중합 정량화에 관심이있는 경우 선택적인 단계입니다. 액틴 중합 식세포 작용에 대한 형광 물질을 사용하여, 최종 목표 인 경우에는 선택적이다. <ol><li> 파라 포름 알데히드 고정 (4.3 단계)에 따라, 각각의 세척에 잘 당 100 μL에 PBS로 두 번 접시를 씻으십시오. 투과성으로 위해 PBS에 0.​​1 % 트리톤 X-100의 50 μl를 추가하고 RT -5 분 동안 품어. </li><li> (상기와 같은)와 함께 밖으로 PBS 0.1 % 트리톤 X-100을 2 회 반복하고, 라베의 비 - 특이 적 결합을 방지하기 위해 20 분 동안 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단리터. </li><li> 차단 후, BSA 솔루션을 제거하고 즉시 로다 민 팔로이 딘을 추가합니다. , 로다 민 얼룩의 작업 용액을 제조 (한 접시에 충분한) PBS 5ml에 (제조업체에서 제공) 메탄 계 용액 100 μl를 사용합니다. 작동 용액에서 웰 당 50 μL를 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양한다. 참고 : 단계에서와 같이 세척 단계와 DAPI 염색을 수행하면 4.4 세포가 정량 준비가 될 것입니다. </li></ol> 6. 정량화 <ol><li> λ = 460 nm에서 λ = 355 nm의 방출 필터의 여기 필터를 사용하여 λ = 518 nm의, 청색 형광에서 λ = 488 nm의 방출 필터의 여기 필터를 사용하여 형광 플레이트 판독기, 레코드 녹색 형광을 사용하여 식균 정량화. </li><li> λ = 355 nm의 λ = 460 nm의 (위)에, 그리고 빨간색 독감을 통해 형광 플레이트 리더, 기록 푸른 형광을 이용하여 액틴의 중합을 정량화하기λ = 584 nm의 방출 필터 λ = 620 nm에서 여기 필터를 통해 orescence. 참고 : 궤도 또는 중앙 감지 녹화 허용됩니다. 일부 세포 유형은 케이스 궤도 기록 이점이 될 수있는 중앙보다 잘의 가장자리 자세히 모인다. 특히, 궤도 주위 3 점의 평균은 더 정확한 결과를 얻기 위해 사용될 수있다. </li><li> 굴지의 정량 (그림 1) 대 입자 라벨 또는 식세포에 따라 (DAPI에서) 푸른 형광 판독하여 녹색 또는 적색 형광의 총 RFU을 나눈다. 때문에 높은 판 - 투 - 플레이트 변화에 가장 잘 관찰 동향을 설명하기 위해 더 신뢰할 수있는 통계 분석을 용이하게하기 위해, (예 = 0 제어를 t에 상대적으로) 상대 인덱스를 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology. , (2012).</li><li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components.">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice.">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633 (2013).</li><li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes.">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621 (2012).</li><li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development,+stress+response,+and+virulence.">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li><li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor.">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li><li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation.">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li><li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory,+GM-CSF-derived+macrophages.">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898 (2013).</li><li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function.">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li><li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRP/anti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation.">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).</li><li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection.">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li><li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology.">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

형광 측정 기술의 주요 제한은 실험 분산뿐만 아니라 광범위한 세척 및 비 부착 세포의 사용과 관련된 세포의 손실이다. 분산이 때문에 원액의 제조 동안 계량 페팅 같은 형광 물질의 변화에​​ 크게 관측된다 실험 실험에서 입자의 동일 번호를 유지하는 정확한 방법이 아니다. (-; 입자는 즉시 및 제거가 t = 0 제어) 실험 간의 편차의 문제를 해결하기 위해, 데이터는 % 탐식 예를 들어, 상대적인 표현으로 변경 또는 제어를 접을 수있다. 분석이 형태의 재현 동향을 생성하고, 컨트롤에서 %의 식균 작용의 값은 실험 실험에서 유사하다. 데이터 분석의이 종류는 3-6 회 반복 실험과 통계적 유의성을 촉진 할 것이다. 형광 측정 기술을 효과적으로 조사 관찰 D 경향을 재현하기 위해 사용될 수있다충분한 데이터 분석을 이용하는 경우, 그 변동의 espite. 한 과학자가 약 6 96 웰 플레이트, 또는 하루에 600 트리트먼트를 실행하는 기술의 마스터 링이 가능하다. 세포 손실은 크게 미부착 된 세포 유형으로 연구에서 관찰되었다. 자기편 세포 유형은 그들이 다수의 광범위한 세척 단계의 견딜 수 있기 때문에 이와 같은 방법으로 사용하는 것이 최고입니다. 주요 중요한 단계는 사진 표백을 방지하기 위해 직사광선에서 형광 구성 요소를 멀리 유지하기 위해주의해야한다. 입자, 라벨, 각각 또는 모든 성분을 함유하는 판을 어둠 속에서 유지 (또는 단순히 알루미늄 호일로 싸서)되어야한다. 또 다른 필수 성분은 접시 내의 복제물 기술의 중요성이다. 때문에 잘 잘 분산 높은으로는 m하기 위해, 피펫 팅 전에 잘 모든 시약을 혼합하고 (하나의 행에 해당) 처리 당 6-8 회 반복 기술이 필수적이다정확하게 데이터의 동향을 관찰 OST. 이와 같은 판 형식의 사용을위한 중요한 추가 고려 플레이트 웰 시약의 비교적 작은 볼륨이 종종 증발하는 경향이 있다는 것이다. 치료 이상 24 시간 인 경우, 이는 가습기 역할을 세포 배양 배지 및 작용제의 증발을 감소시키기 위해, 단독 PBS를 함유하는 (옆 가장자리에 행과 열) 판의 주연 웰을 사용하는 것이 바람직하다. 이 기술은 마스터 상당히 간단하고 관련된 문제 해결은 최소이다. 이 연구를위한 오른쪽 균성 방법을 선택하고 셀 손실을 회피하기 위해서 (비 부착 세포를 사용하는 경우 특히) 세척하면서주의하는 것이 중요하다. 형광 측정 기술의 주요 의미는 형광 입자 내재화 또는 액틴 중합 스크리닝 높은 처리량 방법을 제공하는 것이다. 대부분의 t이러한 현미경 또는 미생물학과 같은 날짜에 사용 echniques 더 노동 집약적과 더 많은 시간을 비교 걸린다. 유동 세포 계측법에 대해 형광 매우 유사한 원리를 이용하지만, 형광 측정에 필요한 분에 비해 정량화하는 시간이 걸립니다. 따라서, 형광 방법은 높은 처리 능력에 크게 기인 식세포 정량 현재의 방법에 대한 좋은 대안이다.

형광 신호의 정량화 널리 유동 세포 계측법, 공 촛점 현미경, 및 ELISA를 다중화 분석을 FRET, PCR에 이르기까지 과학적인 방법의 군중에서 사용되어왔다. 형광 이미징 및 정량화 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있으며, 다양한 세포 과정의 정량 분석​​을위한 훌륭한 도구가 될 수 있습니다. 형광 마커와 그 신호의 사용은 지난 10 년에 혁명되었고, 형광 플레이트 리더의 출현은 세포 과정 동안 방출되는 형광의 높은 처리량 정량화를 촉진했다. 형광 분석은 식균 작용의 정량화에 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 탐식 1800 1 Metchnikoff 의한 식세포의 발견 이후로 검토되고있다. 몇 년 동안, 다양한 방법은 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 병원균 2-5 침입에 대해 선천성 면역 방어에 필수적이 중요한 과정을 조사하기 위해 이용되어왔다. 순서대로 정량 활용 현미경 및 stereological 기술의 이전 방법은 다음 내면화 입자 (수동 또는 소프트웨어의 사용과) 6-8의 계산에 의해 정량화 된 것을 시사하고 있습니다 세포를 시각화합니다. 정량 분석​​ 혼자 현미경을 사용하여 몇 가지 단점 박테리아의 수동 계산은 노동 집약적이고 관찰자 바이어스 경향이라고합니다. 식세포 작용의 정량화에 사용 된 또 다른 방법은 세균 배양 플레이트 상 (탐식 다음) 세포 용 해물로부터 세균의 미생물 도금 방법이지만,이 방법은 부분적으로 살균 메커니즘 내면화 박테리아의 존재를 고려하지 않을 수있다. 이 방법은 현미경에 비해 훨씬 더 노동 집약적이고 분석하는 데 몇 일이 소요됩니다. 유동 세포 계측법 탐식 정량화 가장 빠르고 효과적인 방법을 보인다 많은 그룹 9-11에 의해 이용되어 왔지만, 일반적으로 고비용에서와 연관된이전에 언급 된 분석법에 비해 분석에 필요한 strument는 가장 비싼 방법 만든다. 형광 방법은 엄청난 비용으로하지 형광 사용하여 장비의 편견 정량을 제공하기 때문에 입자 국제화의 분석을 위해 유동 세포 계측법 수있는 좋은 대안입니다. 형광 측정의 다른 추가적인 장점은 고효율 및 내재화 표지에 의해 방출 된 형광 입자를 정량 높은 처리 능력이다. 형광 측정의 장점은 식균 작용 이외의 프로세스의 정량화를 추정 할 수있다. 예를 들어, 형광 분석 액틴 중합 세포 또는 막 - 결합 수용체, 세포 투과성 / 생존력, 형질 전환 효능의 변화, 및 변조의 발현의 변화로 이어지는 모든 프로세스를 연구에 적용될 수있다. 형광 측정 기술의 한 가지 단점은 사용 된 레이블에 따라 하이가있을 수 있다는 것이다실험은 일반적으로 배 변경이나 컨트롤에서 % 증가로 상대적으로 정량화를 통해 데이터를 보여줌으로써 해결할 수 있습니다 변동성을 실험합니다.

<table><tbody><tr><td>1 &amp;mu;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td><td>Molecular Probes</td><td>F8852</td><td>combine 50&amp;mu;l with 50&amp;mu;l opsonizing reagent for 30 min at 37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Heat killed &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BioParticles fluorescein conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>E2861</td><td>reconstitute (5 mg) in 50 &amp;mu;l of PBS and combine with 50 &amp;mu;l opsonizing reagent for 30 min at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Opsonizing reagent</td><td>Molecular Probes</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers:</td></tr><tr><td>RPMI Cell growth media</td><td>Gibco</td><td></td><td>Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Fluorescent plate reader - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>dilute to 4% before use</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>clear or black or clear bottom - black plates</td></tr><tr><td>Multichannel pipette (8 - 12 channels)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagent reservoirs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes (0.6 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conicles (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

형광 분석의 목적 및 기타 탐식 세포 과정을 분석하는 효율적이고 비용 효과적인, 높은 처리량 방법으로 제공하는 것이다. 이 기술은 세포의 다양한 특성을 조사하기 위해, 점착성 및 비 점착성 세포 유형 모두의 다양한 이용 될 수있다. 식균 작용을 연구 할 때, 형광 기술은 대 식세포, 및 그 형광 트리 판 블루의 존재 하에서 소멸 될 수 형광 표지 된 입자로서 옵 소닌 포식성 세포 유형을 이용한다. 96 웰 플레이트, 형광 입자 (녹색 또는 빨간색)에 부착 된 대 식세포의 도금에 따라 투여하고 세포는 시간의 다양한 양의 탐식 할 수 있습니다. 형광 발색 입자의 내재화 후, 세포를 내재화되지 않거나 단지 세포 표면에 부착되는 박테리아로부터 형광 신호의 소멸을 촉진 트리 판 블루로 세척. 트리 판 세척 후, 세포를 고정, PBS로 세척하고,차 세포의 핵에 레이블을 제공 DAPI (핵 파란색 형광 라벨), 염색. 판 핵 (파란색)의 읽기 또는 입자를 통해 간단한 형광 정량 (적색 / 녹색) 형광 우리는 녹색의 상대 형광 단위의 비율을 검사 할 수 있습니다 : 파란색 셀 당 내면화 형광 박테리아의 양을 나타내는 식세포 인덱스를 결정합니다. 세척 96- 웰 방법 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 분석의 기간은, 데이터 취득 종료 탐식 단부로부터, 45 분 미만이다. 유동 세포 계측법 유사한 방식으로 사용하지만 형광 측정의 장점은 높은 처리량, 샘플들의 최소 조작 셀당 형광 강도를 빠르게 정량화 평가의 신속한 방법이다 될 수있다. 유사한 전략은 본질적으로 비 부착 성 세포를 살아있는 박테리아 표지 액틴 중합하고 형광을 이용하여 임의의 처리를 적용 할 수있다. 따라서, 형광 측정 낮은 비용, 높은 throughp 유망한 방법이다세포 과정의 연구에서 유타 기능을 제공합니다.

이 프로토콜의 사용을 통해 식균 작용 및 후속하는 액틴 중합 정량 크게 두 가지 방법이 연속적 또는 동기화 탐식을 관찰하는 것이다. 현미경 분석 (도 1b)는 형광 기록 것과 유사한 형광 화상을 도시한다 (또한도 1 참조). 그림 1B에서 굴지의 적색 형광, FITC의 녹색 268 형광 HKOP E. 레이블입니다 대장균, 핵 DAPI 염색, 그리고 세 269의 병합 된 이미지가 함께 형광. 이 이미지는 효과적인 식균 작용, 액틴의 중합, 비 내면화 입자의 270 효과적인 트리 판 담금질을 나타냅니다. J774 세포 덱스 트란 비드 내재화되는 경우, 각각도 2a 및 C에 도시 된 바와 같이 옵 소닌과 unopsonized 입자의 연속 식세포는 아주 비슷하다. 흥미롭게도, 액틴의 중합 다음 opsonophunopsonized 입자의 액틴의 중합 다음 국제화 (그림 2D)를 증가하지 않는 반면 agocytosis 증가, 나중에 포인트 (그림 2B)로 둔화. 이 opsonophagocytosis이 옵 소닌되지 않은 입자의 내재화보다 훨씬 더 액틴의 중합에 이르게하기 때문에 이러한 프로세스를 검사 향후 연구에 고려하는 것이 중요합니다. MTT 분석 (도 2e)를 통해 확인 된 바와 같이 덱스 트란 입자를 사용 포식성 방법 중 어느 것도 세포 생존율의 변화를 초래한다. 지속적으로 연속 식세포 작용 (그림 2) 동안 관찰 경향을 증가 달리, 옵 소닌 덱스 트란 비드의 동기화 식균 작용은 30 분 다음 국제화의 감소를 보여, 종 모양의 추세 (그림 3A)가 있습니다. 이것은 처리 시간과 프로토콜의 특성을 고려하여 예상 할 수있다. 이러한 경향은 액틴 POL 의해 확인높은 중합 시간 지점 timecourse 초기에 이들 세포의 ymerization 데이터 (도 3b), 기준선 동안 30 분 중합으로 복귀. 더욱 노동 집약적이지만,이 방법에 따라서, 즉각적인 효과를 조사 식세포, 오른쪽 동기화 후 탐식 검사의 값을 갖는다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52195/52195fig1highres.jpg" width="650" /> 그림 1 :. 1 구슬 : 식균 작용과 액틴의 중합의 공 초점 현미경은 세포가 20 FITC 복합 OPDex 비드 (녹색)을 내면화하는 것이 허용되었다 60 분 동안 세포 비율, 다음 세포, paraforlmaldehyde 고정, 트리 판과 PBS로 세척와 permeabilised했다 아세톤, 및 로다 민 팔로이 딘 (빨간색)를 사용하여 F-굴지의 스테인드 및 DAPI (파란색). 추가 디지털 사진 배율 60X에서 공 촛점 현미경 분석을 도시하는 도면 (A) 엉E 바 = 10 μm의 (B) 화이트 바 = 50㎛의. (A)를 첨가 한 다음 억제제 액틴 중합 변화 도면. 화살촉은 pseudopodia 형성을 표시하고 화살표. 그림 1a는 닌코 비치와 로이 (12)에서 수정 된 막 파동 운동의 변화를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52195/52195fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52195/52195fig2highres.jpg" /> .도 2 : 연속 탐식 J774 뮤린 대 식세포 다음 형광 측정 분석은 96 웰 플레이트에 도말하고 90, 60, 45, 30 및 15 분에서 시작 시간에서 다양한 양의 덱스 트란 비드에 노출시켰다. 비즈는 서로 다른 시간과 모든 반응이 동시에 정지시켰다 대한 탐식 과정에서 첨가 하였다. 세포고정 트리 판으로 세척 염색하고, 다른 각 (B, D 각각). (E) MTT 분석을 수행 하였다 직후의 식균 작용과 관련된 옵 소닌 (A)의 식균 작용 또는 unopsonized (C) 덱스 트란 입자 및 액틴 중합에 대해 분석 하였다 시점. 이 수치는 닌코 비치와 로이 (12)에서 수정되었습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52195/52195fig3highres.jpg" /> 도 3 :. 다음 동기화 탐식 FITC 형광 측정 분석은 OPDex 비드 / 웰 × 104 세포의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 J774 도금 뮤린 대 식세포에 첨가하고 표지. 30 분 배양 후, 플레이트를 5 분 동안 500 XG에서 원심 분리 하였다. 탐식 PBS 세척, 파라 포름 알데히드 fixati 다음 트리 판 세척하여 X 축에 명시된 시점에서, 한 번에 하나의 정지시켰다에 액틴 염색. 이 수치는 닌코 비치와 로이 (12)에서 수정되었습니다.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization at JoVE.com

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

high-throughput-fluorometric-technique-for-assessment-macrophage

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K 조회수.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

비디오: High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

연구

면역학 및 감염병학

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

대식세포식세포의 중간엽 줄기세포 조절; 수량 및 이미징

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

신경과학

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

생물학

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...