Name: a possible zebrafish model of polycystic kidney disease: knockdown of wnt5a causes cysts in zebrafish kidneys
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys at JoVE.com

이 작품은 (LH하는 DK093625 및 DK069909 및 DK047757 JHL에) NIH에서 지원하고, VA (우수상 JHL에 I01BX000820). 우리는 필수적인 지원을 제공하기 위해 펜실베니아 Zebrafish의 핵심 대학에서 박사 마이클 팩 박사 지에 그에게 감사의 말씀을 전합니다.

참고 : 윤리 선언문 : 모든 제브라 피쉬 실험 동부 버지니아 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 모르 폴리 노 준비 <ol><li> (그림 1A) 제조업체의 지침에 따라 관심의 유전자에 대한 설계 및 합성 번역 차단 ((behavior)을 증대) 및 스플 라이스 억제 (Splice-) 안티센스 모르 폴리 노 (MO) 올리고 뉴클레오티드. 표 1에서 제조업체의 정보를 참조하십시오. 참고 : 수법의 살인은 유리 병에 동결 건조 된 주식으로 제공됩니다. </li><li> 25 ㎍ / μL의 최종 농도 수법의 살인을 다시 중단 유리 병에 고급 멸균 물을 추가합니다. 올리고 뉴클레오티드가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. 일부 고체 남아있는 경우, 5 짧게 분 소용돌이 (10)에 65 ° C에서 주식 올리고 뉴클레오티드 솔루션을 포함하는 유리 병을 가열한다. </li><li> RT에서 MO 주식 솔루션을 저장합니다. 4 ° C 또는 -20 ℃에서 보관하지 마십시오; C 낮은 온도는 MO 올리고 뉴클레오티드가 용기 벽에 바인딩하는 원인이 될 수 있기 때문이다. 분광 광도계를 사용하여 원액의 농도를 측정 새로운 MO의 원액 때마다 (표 1 참조). </li><li> 원하는 용량에 높은 수준의 멸균 수와 원액을 희석하여 주입 당일 MO 작업 솔루션을 준비합니다. 0.05 %의 농도에 도달하기 위해 0.5 % 페놀 레드를 추가한다. 예를 들어, 15 NG / 거리 nL의 농도와 5 μL 작업 솔루션을 만들기 위해, 3 μL MO 원액 0.5 μL 0.5 % 페놀 - 빨간 물 1.5 μL를 추가. 참고 :이 작업 농도, 주입의 각 드롭 (500 PL)는 MO의 7.5 NG를 포함하고 두 방울 MO의 15 NG가 포함되어 있습니다. </li></ol> 사출 장치의 제조 2 <ol><li> 구매 유리 (자세한 내용은 표 1 참조) 바늘을 미리 뽑아. 대안 적으로, 유리 주사 바늘 WI 당겨바늘 풀러를 토륨. </li><li> 공기 압축기의 전원을 켜고 50 PSI에 압력 설정을 조정합니다. 해부 현미경 광원과 피코 마이크로 분사 펌프를 켜고 다음과 같이 설정을 조정 : 압력 20 psi의를 개최, 압력 10​​ psi의 게이팅, 2.5 100 마이크로 초 범위의 기간 값을 꺼냅니다. </li><li> 주입 액 5 μL와 유리에게 미리 뽑아 바늘을 넣고 끝이 아래로 가리키는 수직으로 바늘을 배치합니다. 모든 솔루션은 눈에 보이는 공기 방울 바늘 끝을 도달 할 때까지 기다립니다. 현미경 옆에 적절한 위치에 바늘 홀더를 놓고 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다. 45도까지 분사 각도를 조정합니다. </li><li> 높은 단계 떨어져, 현미경으로보기에 바늘 끝을 가지고, 그리고 팁의 얇은 지역에 초점을 맞추고있다. 좋은 점 핀셋으로 바늘 끝을 끊다. </li><li> 통치자와 현미경 측 0.15 mm 측의 내경 모세관을 배치;액주 있도록 모세관 튜브의 일단에 용액을 주입. 1mm 길이 액체 열 당 각 17 방울에 도달하는 배출 시간을 조정 한 후 한 방울의 부피는 1 NL 액주의 = π X 반경 2 × 길이 (드롭 볼륨 () 방울 / 수 ()입니다. 주 : 0.1 mm의 직경을 갖는 약 500 드롭 (PL)의 주입량 (방울 부피 = 4/3 X X π 반경 3) 준다. </li></ol> Morpholinos 3. 수정란 제브라 피쉬 배아의 준비 및 주입 <ol><li> 표준 제브라 피쉬 사육 및 유지 보수에 대해 게시 된 프로토콜에 따라 형질 전환 제브라 피쉬의 번식 쌍 : Tg는 (GFP wt1b)를 설정합니다. 자연 산란 후 배아를 수집하고, E3의 물이 가득 10cm 페트리 접시 (5mM의 염화나트륨, 0.17의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘 (2), 0.33 mM의 황산)에 보관하십시오. 바로 13 MO 주입을 시작합니다. 현미경으로 배아 형태를 모니터링하고 있는지 확인 MO 주입은 원 -에있다세포 단계 또는 4 셀 단계 이하 버전 이상이 필요합니다. <ol><li> 와 10cm 페트리 접시에 배아를 전송 골짜기 한천 쐐기 모양. 여분의 E3 물을 대기음 부드럽게 골짜기로 배아를 누릅니다. </li><li> 해부 현미경 1 세포 단계의 배아를 시각화하기 위해 마이크로 피펫으로 배아를 조작 할 수 있습니다. 노른자 (1 방울 = 500 PL)에 MO 중 하나 또는 두 방울을 주입 할 수있는 융모막 노른자를 침투. E3 물 10cm 페트리 접시에 주입 된 배아를 전송하고 28.5 ° C에서 배양한다. </li></ol></li><li> 주사 후, 죽은 배아를 제거하고 주입 된 배아의 수를 기록한다. 접시마다 24 ~ 48 시간의 E3 물을 교체합니다. </li></ol> 4. 표현형 구조 실험 <ol><li> 구출 용 MO에 내성 때문에, 다른 기본 염기쌍 구조 (일반적으로 3-7 염기쌍 불일치)을 가지고 있으며, 또 다른 종으로부터 orthologue을 선택. 예를 들어,이 실험에서, 우리는 선택한마우스 Wnt5a 마우스의 mRNA 서열은 서열 지브라 피쉬 다르기 때문에. </li><li> 정방향 프라이머가 번역 사이트와 mRNA의 코딩 영역의 끝 가까이에있는 역 프라이머로 시작하는 프라이머 세트를 디자인합니다. 정방향 프라이머 서열의 5&#39;- 말단에 T7 프로모터 서열을 추가한다. 이 실험에서는 다음의 프라이머를 사용하여 서열; 앞으로 : 5&#39;-TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA A-3 &#39;및 역방향 : 5&#39;-TCA CTT GCA GAC GTA CTG gtc- 3&#39;. </li><li> 상기 설계된 프라이머 세트 (각 프라이머의 0.5 μM)과 다음 PCR 프로그램 마우스 Wnt5a cDNA 서열 함유 0.1 μg의 주형 DNA와 50 μL 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행 : 5 분 동안 95 ° C에서 1 사이클; 95 ° C (30 초), 58.5 ° C (30 초), 72 ° C (1 분)의 35주기; 최종 확장 단계 7 분 72 ° C에서. </li><li> t을 마친 후그는주기, 밴드가 적당한 크기인지 확인하기 위해 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 2 μl를 실행합니다. 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트와 PCR 생성물을 정제 하였다. 분광 광도계로 DNA 농도를 확인합니다. -20 ℃에서 정제 된 PCR 생성물을 저장하거나, 다음 단계에서 직접 캡핑 RNA 전사에 사용한다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 캡핑 RNA 합성 키트와 함께 캡핑 된 mRNA를 in vitro에서 합성한다. 20 μL의 RNase없는 물에 희석시키고 mRNA의 농도를 결정한다. -80 ° C에서 RNA 및 저장 나누어지는. </li><li> 주사 당일의 RNase없는 멸균 수와 mRNA를 작동 용액을 제조 하였다. 40 페이지가 RNA의 비특이적 독성 효과가 발생하지 않는 가장 높은 R​​NA 량은 일반적으로합니다. 얼음에 작업 솔루션을 유지합니다. MO와 배아 다음 구조의 mRNA를 주입하거나 함께 모두 공동 주입. 예를 들면, mRNA의 농도 위해 준비각 주입 단계 4.5 ED는 0.08 ㎍ / μL의 최종 농도를 만들기 위해의 RNase 무료 물 4.33 μL로의 mRNA (0.4 μg의)의 0.67 μl를 추가, 0.6 ㎍ / μL이고, 다음 한 방울 (500 PL)은 40 페이지를 포함 의 mRNA. 3 단계에 설명 된대로 MO를 준비합니다. </li></ol> 형광 이미징 주입 된 배아 5. 준비 <ol><li> 28.5 °에서 배양 후 CO / N은, 형광 현미경을 이용 pronephros 구조의 관찰을 melanization 영향을 방지하기 위해 E3 물 0.003 % N-페닐 티오 (PTU)를 추가한다. 그것은 초기 배아 발달에 영향을주기 때문에 그러나, 낭 배기 전에 PTU를 추가하지 않습니다. </li><li> 48 HPF에서 수동으로 미세 핀셋으로 배아를 d​​echorionate. 빛 해부 현미경으로 48, 72 HPF 배아의 이미지를 가져 가라. 참고 :이 사진을 마취없이 촬영할 수 있습니다. </li><li> , 형광 현미경 이미징에 넣어서 배아를 마취 약 10 분 전에160 ㎍ / ㎖의 버퍼 Tricaine을 포함 10cm 페트리 접시. 5 ~ 10 분 동안 기다린 후 가볍게 움직이지 않게 때문에 마취가 작동하는지 확인하기 위해 제브라 피쉬를 터치합니다. </li><li> 배아가 마취 후 (표 1 참조) 3 % ​​메틸 셀룰로오스를 장착하고는 해부 현미경 하에서 발생하기 쉬운 위치에 방향. </li><li> 형광 현미경 pronephros 구조를 관찰한다 (표 1 참조) 및 다른 배율 (10 배 및 20 배)에서 사진을 찍을. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

다낭성 신장 질환 (PKD)는 인간에서 말기 신장 질환의 주된 원인 중 하나이며, 프로그레시브 낭종 형성, 신장 확대 및 비정상적인 세관 (14)에 의해 발전을 특징으로한다. 상 염색체 우성 PKD (ADPKD)은 유전 질환 인 중 하나 PKD1의 돌연변이, polycystin-1 (PC1), 또는 PKD2를 인코딩 polycystin-2 (PC2)를 인코딩, 다낭성 신장의 결과. 다른 많은 유전자, 차 섬모에있는 단백질을 코딩 특히는, 신장 낭종의 개발에 관여하는 것으로 생각하고, 지금까지이 유전자를 선별하는 이상적인 도구가되지 않습니다. 우리는 zebrafish의 유전자 최저 후 신장 낭종 형성을 관찰하는 빠르고 쉬운 방법을 설명합니다. 이 방법은 다른 가능성 PKD 후보 유전자를 스크리닝하기 위해 사용될 수있다. 이 기술의 장점 중 하나는 단순하다. Tg는 (wt1b : GFP)에서 제브라 피쉬, GFP의 발현은 특정을 만드는, 사구체, 세관 및 덕트에LY 적합한 모델은 전체 pronephric 신장의 구조를 연구한다. Tg는 (wt1b : GFP) 제브라 피쉬는 유전자 후 pronephric 구조와 신장 낭종 형성의 직접 시각화 허물고 있습니다. 그것은 Wnt5a 최저은 PCP 경로 결함과 생쥐의 신장 낭종 형성의 원인이 의심되었다. 그러나, Wnt5a의 글로벌 녹아웃 쥐에 치명적인 출생과 출생 후 신장 낭종 형성을 관찰하는 데 사용할 수 없습니다. 단시간에, 여기에 기재된 방법을 사용하여이 제브라 피쉬 넉다운 wnt5a 신장 낭종 형성 귀착 것으로 판정 하였다. 이 결과, 다음 단계는 신장 특정 Wnt5a 녹아웃 마우스를 생성하는 것이다. 이 기술은 몇 가지 제한을 갖는다. 이는 좋은 항체의 MOS없이 효능을 추정하고, MO는 표현형을 야기하는 부적절한 유전자의 기능을 억제 할 수있는 가능성을 배제하기 어렵다. 광범위한 제어 experimeNTS은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요하다. 두 가지 수법의 살인, 월 - MO와 splice- MO는 wnt5a 최저를 평가하는 데 사용되었다. 두 morphants 서로 phenocopied, 마우스 Wnt5a mRNA를 주입 일차 염기쌍 구조의 차이에 의한 MO들에 대한 내성 표현형 MO &quot;오프 - 타겟&quot;효과에 기인 아니라고 보여주는 비정상적인 표현형 구출. 우리의 모델은 wnt5a 최저은 제브라 피쉬 배아 신장 낭종 형성을 일으키는 것을 보여줍니다. 간단하고 덜 시간 소모적이기 때문에이 방법은, 신장 낭종 형성을 일으키는 것으로 의심되는 다른 많은 유전자를 테스트하기 위해 사용될 수있다. 이는 제브라 피쉬 신장 포낭 형성 유전자 돌연변이의 결과는, 상기 실험 신장 낭종 형성의 기작을 조사하기 위해 실시 될 수 있다는 사실이 처음으로 밝혀지면. Wnt5a 글로벌 녹아웃 마우스는 생후 치명적이며 사용할 수 없기 때문에 본 실험에서는,하기 OB출생 후 신장 낭종 형성 봉사, 다음 단계는 치운다 LOX 시스템을 이용하여 신장 특정 Wnt5a 녹아웃 마우스를 생성하는 것이다.

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 배아 신장 널리 개발 다낭성 신장 질환을 연구 모델로서 이용되어왔다. 가지 동물 모델로서 지브라 피쉬를 사용하는 많은 장점 : 유전 결합 연구의 타당성은, 단백질 녹다운 대한 안티센스 morpholinos (MO)를 사용하는 능력은, 기회 신속 배아 다수를 분석하는, 그리고 오르간 표현형을 쉽게 볼 애벌레 한 생활. pronephros는 척추 동물에서 개발 한 최초의 신장과 애벌레 제브라 피쉬 2에서 작동합니다. pronephros 지브라 피쉬의 구조는 포유류 metanephros 비교적 간단한 비교되고, 마지막 세 번째 신장 포유류 개발. 네프론 어려운 네프론 단일 구조를 관찰 할 수있어 네프론 500,000-1,000,000 3,4- 약 13,000 네프론 (5)를 각각 갖는 마우스 신장 사이 각각 함유 인간 신장과 신장의 작업 단위 In은 인간 또는 마우스 신장. 제브라 피쉬는 두 개의 네프론을 가지고 있으며, 각각의 제브라 피쉬 네프론은 사구체와 생쥐와 인간 (6)와 유사한 전문 신장 세포 유형의 세관에있는 모든 주요 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이 닫힌 시스템 (7)을 가지고 있기 때문에 이러한 제노 같은 다른 척추 동물 모델에 비해, 제브라 피쉬 네프론보다 자세히 포유류 네프론을 닮았다. 최근, 제브라 피쉬 게놈 유전자 툴, 광범위한 돌연변이 자원, 제브라 피쉬 모델에서 트랜스 제닉 리포터 라인 모음 넓은 도입을 허용 서열화되었다. 12-72 시간 포스트 수정 (HPF) 간의 제브라 피쉬의 pronephros 양식은 투명 배아에서 쉽게 시각화 할 수 있습니다. Wilm의 종양 단백질 WT1 신장 개발을위한 필수적인 요소이다. wt1b 프로모터의 Tg의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 선 (wt1b : GFP) GFP의 expre을 보여ssion는 특히 17 HPF (8)에서 시작, 제브라 피쉬 배아에서 pronephric 지역에 위치하고 있습니다. Nephronophthisis (NPHP), 상 염색체 열성 낭성 신장 질환, NPHP 유전자 (9)의 돌연변이에 의해 발생합니다. (wt1b : GFP) 모르 폴리 노에 의해 넉다운 NPHP4은의 Tg 낭종 형성 원인이되었다. 물고기를 10 따라서,이 형질 전환 어류 신장 개발하는 동안 신장의 구조와 낭종 형성을 관찰에 적합한 모델입니다. 중요한 것은, 개발 신장의 조절제의 영향은 시간 및 노동 효율적인 방법으로이 균주를 사용하여 조사 할 수있다. 유전자 변조 후 신장 낭종 형성을 시각화하는 모델로 물고기 : 우리의 종이는 Tg가 (GFP wt1b)의 사용에 대해 설명합니다. 우리는 제브라 피쉬의 wnt5a 유전자를 허물고 시작 - 및 스플 라이스 - 사이트 안티센스 수법의 살인을 사용했다. Wnt5a 각종 장기 및 세포 생후의 개발에 중요한 역할이 Wnt 계열의 비정규 분비 된 당 단백질기능 11. Wnt5a은 신 세뇨관 신장 동안 지향 세포 분열에 중요한 역할을하는 것으로 확인되었습니다 평면 셀 극성 (PCP) 경로를 포함하여 비정규의 Wnt 경로를 통해 작동합니다. Wnt5a 더함으로써 Vangl2 안정성 12을 촉진 VANGL 평면 셀 극성 단백질 2 (Vangl2)와 복합체를 형성함으로써 Wnt5a 시그널링을 transduces 티로신 키나제와 같은 수용체 (RYK)과 복합체를 형성함으로써이 Wnt / PCP 경로를 조절한다. PCP 경로의 결함은 임의의 세포 분열을 초래할 신장 낭종 형성의 원인이 될 수 있습니다. wnt5a 최저 다음 신장 낭종 형성을 관찰하는 제브라 피쉬 라인 : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)을 사용했다. Tg는 (wt1b : GFP) 제브라 피쉬 모델은 라이브 이미징 및 신장 구조의 적시 관찰 할 수 있습니다. wnt5a 최저 후, 신장 낭종 형성은 24 HPF에서 시작 발견되었다; 72 HPF에서 낭종은 사구체 근위 세뇨관에서 볼 수 있습니다. 이 방법은 또한 (S)에 사용될 수있다신장 낭종 형성 발생할 수 있습니다 creen 다른 유전자.

<table><tbody><tr><td>0.5% Phenol-Red</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Color indicator for injection</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td><td>(customized)</td><td>Customized designed to the gene of interest</td></tr><tr><td>Pre-pulled needle</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>For prevention of melanization</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia</td></tr><tr><td>Methyl Cellulose</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>For position of zebrafish&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>For purification of PCR product for cap RNA synthesis.</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>For PCR</td></tr><tr><td>Tag DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>For PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>For measure morpholino and RNA concentration</td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Air source for injection</td></tr><tr><td>Pico micro-injection pump</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Other types of microinjection system can be used.</td></tr><tr><td>Micro-manuplator</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Right-handed (MMJL for left handed)</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>To hold needle for micromanipulation</td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11253-20</td><td>For breaking off the needle tip</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica M205C&amp;nbsp;</td><td></td><td>For observing and imaging zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Fluorscence microscope</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging zebrafish pronephros</td></tr><tr><td>Capillary tube (I.D. 0.15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>For measure the volume of each injected drop</td></tr></tbody></table>

a possible zebrafish model of polycystic kidney disease: knockdown of wnt5a causes cysts in zebrafish kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Wnt5a 노크 번역 MO 차단을 도입하여 달성되었다 (AUG-MO) 또는 하나의 셀 단계에서 제브라 피쉬 배아에 엑손 / 인트론 경계 스플 라이스 MO (스플 라이스-MO). 월 - MO 따라서, 두 모자 접합체 wnt5a 메시지를 억제, 개시 코돈을 대상으로합니다. MO-접합부는 제 스플 라이스 공여 부위를 표적으로 wnt5a (도 1A)만을 전사 접합체를 억제한다. (behavior)을 증대하고 splice- morphants 곱슬 꼬리를 아래로 몸 축과 심낭 부종 (그림 1B)를 포함, 여러 결함이 서로 phenocopied. 마우스 Wnt5a mRNA를 부분적으로 표현형 오프 대상 효과로 인해 아니라는 것을 보여주는 morphant 표현형 (그림 4B)을 구출. (TG wt1b : GFP)는 GFP wt1b의 내인성 발현을 되풀이되도록 wt1b 프로모터에 의해 구동 GFP를 발현하는 형질 전환 지브라 피쉬는, pronephric 구조의 개요를 설명 하였다. Tg는 (WT1B : 제어 배아 페놀 레드 주입 반면 GFP) 물고기는 혼자 측면 (그림 2) 확장 tubules와 &quot;U&quot;모양의 융합 사구체를 형성, 정상적인 pronephric 개발을 표시, 48 HPF에서 wnt5a 최저 후 사구체 낭종 형성을 보였다. 72 HPF에서 사구체 구조물은 (behavior)을 증대 및 스플 라이스-MOS 모두 사구체 근위 세뇨관 (그림 3)에서 낭종을 개발, 쉽게 시각화 혈관 루프가 개발했다. 72 HPF의 morphant 배아의 가로 조직 학적 섹션의 H &amp; E 염색, 낭종 형성을 밝혀 사구체 구조와 팽창 신장 세뇨관 (그림 4A)를 중단. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 모르 폴리 노 디자인과 72 시간 포스트 수정 (HPF) 다음 주입에 제브라 피쉬 배아의 광학 현미경 외관페놀 레드 제어, 월 - MO, 또는 스플 라이스-MO와. (A)은 다이어그램 지브라 피쉬 wnt5a 유전자 코딩 영역, 및 (behavior)을 증대하고 splice- MO의 대상 영역을 도시. wnt5a의 월 - MO는 단백질 번역을 차단하기 위해 ATG 시작 코돈을 대상으로 설계되었다; 스플 라이스-MO는 어떤 스플 라이스 접합이 완전 또는 부분 단일 엑손 삭제 또는 전체 또는 일부 단일 인트론 삽입를 생성 할 것으로 예상된다 향한 엑손 3, 4 스플 라이스-MO 올리고의 테두리를 대상으로 설계되었다. 우리는 특이성을 높이기 위해, 모성 및 접합체 메시지에 영향을 미치는 월 - MO, 만 접합체 성적에 영향을 미치는 스플 라이스-MO, 모두 wnt5a을 노크하기로 결정했습니다. (B) 페놀 레드 주입 된 배아를 ( 분사 제어)는 정상적인 신체 곡률, 길이 및 심낭을 보였다. 월 - MO로 주입 된 배아 스플 라이스-MO 주입 하향 곱슬 꼬리 구조와 심낭 부종 및 배아 phenocopied을 보여 주었다배아의 외관은 월 - MO 주입. 바 = 2mm. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig2highres.jpg" /> 그림 2 : Tg는 (wt1b : GFP)의 형광 현미경 모양. 페놀 레드 제어, wnt5a 월 - MO 또는 wnt5a 스플 라이스-MO와 주사 후 48 HPF에서 제브라 피쉬 배아 페놀 레드 분사 제어에서 pronephros 개발은 48에서 완료 HPF. 두 융합 사구체 근위 세뇨관을 알 수있다. 낭종 형성은 (behavior)을 증대 및 스플 라이스-MO 제브라 피쉬 pronephros 개발 (바 = 100 ㎛)의 말 HPF (48)에서 배아 모두 사구체에서 관찰 할 수있다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig3highres.jpg" /> 그림 3 : Tg는 (wt1b : GFP)의 형광 현미경 외관 주입 후 72 HPF에서 제브라 피쉬 배아 페놀 레드제어, wnt5a의 월 - MO 또는 wnt5a 스플 라이스-MO. 72 HPF에서 사구체 구조는 명확하게 시각화 할 수 있습니다. 페놀 레드 분사 제어에서, 두 개의 융합 사구체 혈관 루프는 관찰 할 수있다. Wnt5a 최저은 사구체 근위 관 지역 (바 = 100 ㎛)을 포함하여 시각화 할 수있는 모든 네프론 구조에 낭종 형성의 결과. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig4highres.jpg" /> 그림 4 : 72 HPF의 morphant 배아의 가로 조직 학적 섹션 (A) H &amp; E 염색, 낭종 형성을 밝혀 사구체 구조와 팽창 신장 세뇨관을 중단. 화살표 : pronephric 사구체; 화살촉 : 신장 가느 다란 관을 팽창. 막대 = 20 μm의. (B) 월 - MO 표현형은 부분적으로 차 염기쌍 구조의 차이에 MO에 내성 마우스 Wnt5a로 구조 될 수있다함으로써 표현형이 표적 이탈 효과에 기인 아니라고 입증. 차이는 P &lt;0.05에서 통계적으로 유의했다 (* P &lt;0.05 페놀 레드 그룹 대 #의 P &lt;0.05 월 - MO 15 NG 그룹 대).

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A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em&gt; wnt5a</em&gt; Zebrafish의 신장의 낭종 원인

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

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A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

11.1K 조회수.  Eastern Virginia Medical School. We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish. 

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

연구

발생학

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

신경과학

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

생물학

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

성인 얼룩말 피시에 있는 Cisplatin에 의해 유도된 급성 신장 상해 모형

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

의학

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운

요약

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