Name: shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing at JoVE.com

우리 지도 대 한 척 Kimmel, 존 다우드가 번 식 전략 개발에 대 한 도움, 골격 얼룩, 완성에 그녀의 작품에 대 한 Macie 워커 및 Charline 워커와 보 니 울만 도움이 zebrafish 조언을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 JTN K99/R00 DE024190에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 설명 하는 모든 실험 따라 그리고 콜로라도의 대학 및 대학 오 레 곤 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 완성 되었습니다.
 1. 선택 되지 않은 시작 재고 준비 <ol><li>식별 heterozygous 항공사의 지 느 러 미에 의해 돌연변이 체 대립 유전자의 클립 11 및 유전형 전체 형제 동물의 주식 선택의 방법으로와 같은 KASP 12 , , 13 14. 이 프로토콜 zebrafish mef2ca b1086 긴장 수행 되었다.</li>
	<li>KASP 유전형 
	참고: KASP 위한 대립 유전자 특정 뇌관 (재료의 표 참조) 시 약을 제공 하는 회사에 의해 설계 되었습니다. 특정 실시간 PCR 기계에 대 한 적절 한 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) 염료 농도 회사 웹사이트를 방문.
	세포의 용 해 버퍼 (10 mM tris (pH 8.3), 50 m KCl m, 1.5 m m MgCl 2, 0.3% 비 이온 계면 활성 제, 0.3 %Octylphenyl-폴 리 에틸렌 글리콜)의 <ol><li>장소 zebrafish 꼬리 조직 50에서 µ L. 2-5 h 20 분 94 ° C 비활성화 단계 뒤 55 ° C에서 열 cycler에 96-잘 PCR 플레이트 및 다이제스트의 당 성분을 K 10 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 소화. 세포 제품을 냉장 참고: 세포 제품 준비 후 몇 달 동안 성공적으로 사용 될 수 있습니다. 조직 50 m m NaOH를 사용 하 여 lysed 했다 때 KASP 반응 실패 했다. 이 발견은 건의 한다 genomic DNA 준비의 NaOH 메서드 KASP와 호환 되지 않습니다.</li>
		<li>게놈 DNA를 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량. 각 반응 포함 약 20-30 ng 되도록 분자 생물학 학년 물을 사용 하 여 게놈 DNA 템플렛을 희석. 
		참고: 4 또는 5 샘플 계량, 그들, 수영장 다음 평균에 따라 모든 샘플에 대 한 희석을 준비 합니다. 이 프로토콜을 성인 꼬리 조직에 사용 하는 경우 1: 100 희석은 종종 충분 합니다. DNA 농도의 정확한 정량화는 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>추가 0.14 µ L KASP 뇌관의 혼합 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 튜브의 하단에 내용을 수집 centrifuging 짧게 전에 잘 믹스에 얼음에 샘플 당 혼합 KASP 마스터의 5 µ L. 
		참고: KASP 마스터 혼합 열 및 민감한 빛 얼음에 대 한 재고 유지 이며, 직접 빛을 하지 마십시오.</li>
		<li>피펫으로 5 µ L 뇌관/마스터의 믹스 솔루션 사용 되 고 실시간 PCR 기계에 대 한 적합 한 96-잘 광학 PCR 격판덮개의 우물으로.</li>
		<li>피펫으로 5 µ L의 희석 (약 5-7 ng / µ L) 각 DNA 템플릿 샘플 고를 섞어 피 펫과 발음.</li>
		<li>Nuclease 무료 물 3 웰 스 노-템플릿 컨트롤 (NTC)으로 희석된 확인된 homozygous 야생 타입, 긍정적인 컨트롤 heterozygous 및 homozygous 돌연변이 DNA 템플렛의 5 µ L을 추가 하는 추가 5 µ L.</li>
		<li>영화에 각 잘 완전히 밀봉 판 보장 광학 투명 필름 밀폐 장소.</li>
		<li>짧게 원심 600 x g 하단에 내용을 수집 하 고 믹스에서 거품을 제거 하 고 접시. 
		참고: 진행 준비까지 빛에서 얼음 및 방패에 접시를 유지.</li>
		<li>표 1에 표시 된 순환 프로그램을 사용 하 여 주요 KASP 반응을 수행 하.</li>
		<li>볼 결과 점도 분석 컴퓨터에 의해 제작. 성공적인 반응 플롯 ( 그림 3)에 포인트의 4 가지 그룹을 표시 됩니다: 3 샘플 유전자, 및 원점 근처 NTCs의 한 그룹에 해당 하는 그룹. 긍정적인 컨트롤 적절 한 샘플 그룹화와 분리 해야 합니다.</li>
		<li>컴퓨터 프로그램에 해당 특정 genotypes, 추가 세트 자전거 하로 그룹화 될 수 있습니다 음모를 인식 하지 못하는 경우 (표 2) 필요 합니다. 반복 하 여 추가 프로그램 유전자 형에 의해 꽉 그룹을 인식 하는 컴퓨터.</li>
		<li>유전형 결과 쉽게 사용 및 분석에 대 한 스프레드시트 파일에 내보냅니다.</li>
	</ol></li> <li>함께 주 물 시스템에 식별된 heterozygous 동물 집.</li></ol>
 2.는 첫 번째 라운드의 자손 득점 <ol><ol><li>동물 핀 클립에서 복구 후 쌍 형제 heterozygotes 크로스 <li>인덱스도 intercrosses을 설정. 디바이 더를 사용 하 여 되도록 배아 동기 16.</li>
		<li>배아를 수집 하 고 계속 감 금 소를 사육에서 고립 된 부모의 쌍.</li>
		<li>호전적인 물고기 분리 하거나 커버와 함께 제공 될 수 있도록 격리 된 성인 모니터링 (났습니다 물고기 멋지게 작업 그물). 물고기를 먹여야 한다 고 그들의 물 고정 물에 IACUC 지침 변경.</li>
	</ol></li> <li>태아 양육 <ol><li>무대 고 표준 조건 17에서 애벌레를 zebrafish 태아.</li>
		<li>Phenotypically 야생-타입 동물 수영 방광 클러치의 75%에 증가 될 때 5 또는 6에 유리 피 펫을 사용 하 여 수집 합니다. 어떤 부모 그들을 굴복 녹음 보육원에서 phenotypic 야생 종류 배치. 
		참고: 있는 치명적인, 사실 많은 골격 돌연변이 열성 돌연변이 체 대립 유전자와 homozygous 돌연변이 형태로 수영 방광 18 , 19 실패. 그러므로, phenotypic 야생 종류 수 있습니다 쉽게 분별 수 비정상적된 수영 방광에 따라 그들의 돌연변이 체 형제 자매에서.</li>
	</ol></li> <li>Alcian 블루/알리자린 레드 연골과 뼈 얼룩 <ol><li>0.17 g/L Tricaine를 사용 하 여 그들의 수영 방광 팽창 하지 않는 애벌레 Anesthetize-배아 미디어에 S. 넓은 구멍 유리 파스퇴르 피펫으로 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 동물을 수집 합니다. 튜브 당 이상의 100 애벌레 추가.</li>
		<li>각 관에서 배아 물을 제거 하 고 관 당 1 x PBS에 2 %paraformaldehyde 1 mL에 동물 수정. 
		주의: 수성 PFA 가연성 이며 심각한 피부와 눈 자극을 일으킬 것 이다. 장갑과 눈 보호와 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 사용 후 손을 씻으십시오.</li>
		<li>1 h 바위; 더 긴 고정 손상 뼈 얼룩. 이 기간 동안 정기적으로 튜브를 확인 하 고 없는 애벌레를 보장 하기 위해 모든 이후 락 단계 측면에 붙어 되거나 튜브의 하단에 clumped.</li>
		<li>유리 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 정착 액 제거, 50% 에탄올과 락 10 분의 1 mL을 추가</li>
		<li>준비 20 µ L의 0.5%를 추가 하 여 솔루션 얼룩 신선한 공기로 Alcian의 1 mL 당 알리자린 레드 (0.04 %Alcian 블루/10 m m MgCl 2 / 80% 에탄올). 50% 에탄올을 제거, 각 관, 그리고 바위에 솔루션을 하룻밤 얼룩의 1 mL를 추가 합니다. 애벌레는 최대 5 일 동안 얼룩에 남아 있을 수 있습니다.</li>
		<li>튜브에서 얼룩이 솔루션을 제거 하 고 각 관을 80% 에탄올/10 m m MgCl 2 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 적어도 1 시간;에 대 한 튜브를 록 명확 하 게 Alcian 블루 얼룩을 생산할 수 있는 하룻밤을 rinsing.</li>
		<li>80% 에탄올/10 m m MgCl 2 솔루션 튜브에서 제거 및 추가 50% 에탄올의 1 mL; 5 분에 대 한 바위</li>
		<li>튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 25% 에탄올과 락 5 분의 1 mL을 추가</li>
		<li>튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 추가 1 mL 신선한 3% H 2 O 2 /0.5% 코 표백 솔루션입니다. 뚜껑 열기와 튜브 마이크로 튜브 랙 또는 희미 한 갈색 채색 솔루션의 위쪽 부분에서 볼 수 있습니다 때까지 약 10 분에 서 보자. 
		참고: 솔루션 위에 거품 형태의 레이어. 주의 타이밍은이 단계에서 필요 이상으로 표백 귀 착될 것 이다 가난한 더블 얼룩.</li>
		<li>표백 솔루션 제거 및 추가 25 %glycerol/0.1% 코의 1 mL; 1 h. 10 분 바위</li>
		<li>튜브에서 25 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거, 각 관, 하룻밤에 10 분 동안 바위에 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션의 1 mL을 추가.</li>
		<li>튜브에서 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거 하 고 다시 각 튜브를 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 추가 합니다. 락 하룻밤 도움이 됩니다 애벌레 내부 누적 될 수 있는 공기 방울을 제거. 사용 하지 않는 저장소 4 ° C에서 골격 준비 스테인드.</li>
	</ol></li> <li>형 점수 <ol><li>점수 스테인드 penetrance 선택한 표현 형의 대 한 돌연변이 자식. 니콜스 외에 1 돌연변이 소성 뼈의 모든 발생에 대 한 득점 했다. 
		참고: zebrafish 부모는 고정 물에 알리자린 레드 얼룩 시간 함께 사라질 수 있기 때문에, 그것은 중요 한 골격 준비 완료의 몇 일 이내에 해골 점수.</li>
		<li>Penetrance는 표현 형을 가진 유전자 형의 비율 이다. 다음 수식에 의해 계산 하는 백분율 penetrance: %penetrance (표현 형을 가진 돌연변이) = / (돌연변이의 총 수) × 100</li></ol></li></ol> 3. 가족 선택 <ol><li>선택 2 높은 penetrance, 다음 세대에 대 한 두 개의 낮은 penetrance 가족. Penetrance, 뿐만 아니라 통치와 활기; 전파 하는 가족을 선택할 때 고려 하는 것이 중요 하다 이 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>줄 각 부모의 쌍 하위 재고 식별자: 가족.01,.02, 등</li>
	<li>집 여러 혼합된 섹스와 메인 시스템에 부모의 쌍 &#39; 동반자 &#39; 물고기. 동반자 물고기 수 영구, 명백한 구별 기능, 변경 된 착 색 또는 탄 미 익 구조 등 어떤 제 브라 라인. 
	참고: 많은 연구원은 성공적으로 탱크에 쌍만 사육 유지할, 호의 베푸는 결과 볼 수 있습니다 여러 동반자 물고기와 쌍을 주택으로. 이 선택적 단계 더 큰 학교에 보관 하는 동물의 사육을 허용 하 고 그래서 그들은 수 있는 반복적으로 교차 필요에 따라 쉽게 검색. 부모의 쌍 대 전체 형제 가족; 생성 하 반복적으로 교차 수 있습니다. 같은 부모의 쌍 교차 반복 하기 전에 적어도 일주일 기다려.</li>
	<li>추려 단계 2.2.2에서에서 애벌레 가족. 그 다음 세대에 대 한 선택 하지 했다.</li>
	<li>탱크 그들의 돌연변이 체 형제에서 penetrance로 선택한 가족에서 야생-타입 형제 애벌레를 포함 하 고 정상적으로 성인 기에 발생.</li>
	<li>차세대 적어도 4 개의 풀-형제 가족, 위쪽 라인에 대 한 두과 아래쪽 라인에 대 한 2를 해야 합니다.</li>
	<li>애벌레 도달 성적인 성숙, 반복 새로운 세대와 함께 1 단계부터 시작 하는 프로토콜.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

선택적인 Breeding 유전자 기능의 예민을 발표
더 또는 덜 심각한 선택적인 breeding에 의해 돌연변이 고기 이동 유전자 기능에 새로운 통찰력을 얻을 하는 간단한 방법입니다. 선택 되지 않은 번 식의 표준 방법으로 비교, 여기에 제시 된 프로토콜 돌연변이 고기의 훨씬 더 완전 한 이해를 얻을 수 있습니다. 특히, 심한 긴장을 생성 하 여 돌연변이 고기의 전체 폭 수 ?...

Zebrafish는 골격 발달을 이해 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 돌연변이 제 브라 긴장와 생물학 skeletogenesis 동안 유전자 기능을 해독할 수 있습니다. 그러나, zebrafish 골격 돌연변이 고기 가변 penetrance1,2,,34 개발 및 유전자 분석을 방해할 수 있는 제시할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 3 겹 이다. 첫째, 지속적으로 심각한 고기 생산 zebrafish 돌연변이 라인 생성 시간 경과 기록5 와 이식6같은 다운스트림 발달 연구 수 있습니다. 연구의 이러한 종류 고기 일관성 명단만 공부 하 여 무력화 될 수 있습니다. 둘째, zebrafish 긴장 inbreeding 유전 배경 변화, 따라서 실험 일관성과 재현성을 홍보를 줄일 수 있습니다. 예를 들어 모든 현장에서 수행 교 잡 분석 한 선택적으로 타고 난된 긴장에 수 혼란 가변성을 감소 하며 결론을 강화. 셋째, 심각 하 고 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 특정 돌연변이에서 발생할 수 있는 전체 phenotypic 시리즈를 발표할 예정 이다.
언뜻 보기에 치명적인 돌연변이의 선택적인 breeding 불가능 보인다. 선택에 대 한 득점은 동물 들이 죽은 때 어떻게 penetrance에 대 한 하나의 품종을 수 있습니까? 다행히, 가족 선택, 테스트, 특히 자손에 의해 선택적인 breeding 방법 많은 년7,8에 대 한 프로그램을 사육 하는 가축에 효과 증명 하고있다. 이 프로그램 주로 암소에 우유 생산 또는 할 꺼야에 계란 생산 한 섹스에만 되는 특성에 대 한 선택적인 breeding에 사용 됩니다. 이 종족의 남성을 직접 득점 수 없습니다 하지만 그들의 자손은 득점 하 고 값은 부모에 게 할당. 이 전략에서 대출, 여기에 제시 된 프로토콜 고정 및 스테인드 돌연변이 자손 zebrafish의 쌍에서 관심사의 돌연변이 유전자에 대 한 heterozygous는 득점을 포함 한다. 어떤 개인은 라인에 다음 세대를 생산할 예정 이다 결정할 때 homozygous 치명적인 돌연변이 자손의 표현 형의 penetrance 부모에 게 할당 됩니다. 우리는이 방법은 penetrance zebrafish 치명적인 골격 돌연변이1에 이동 하는 효과적인 수단을 찾으십시오.
다른 연구와 마찬가지로,이 선택적인 breeding 프로토콜 클러치 크기, 자손의 생존, 배아, 그리고 섹스 비율9의 정상적인 개발 고려 조건에서 걸립니다. 그러나, 이러한 요인은 돌연변이 penetrance 이동의 목적으로 돌연변이 배경의 맥락에서 모두 간주 됩니다. 따라서,이 프로토콜 배경 동질성을 증가 뿐만 아니라 발달 돌연변이 분석을 강화 하는 방법을 제공 하 여 이전 선택적인 breeding 패러다임을 확장 합니다.
이 프로토콜 사전에 안정적이 고 신속한 유전형 프로토콜을 개발 하는 것이 중요 하다 그래서 광범위 한 유전형을 요구 한다. 그러나 많은 유전형 프로토콜 사용할 수 있는10,11, 우리는 KASP 유전형12,,1314 찾을 빠릅니다, 더 비용 효율적인, 그리고 방법 보다 더 신뢰할 수 있는 증폭된 시퀀스10의 제한 효소 절단을 기반으로 합니다. 따라서, 우리는이 작품에서 KASP 프로토콜을 포함. 또한, 우리는이 프로토콜에 골격 돌연변이 고기에 집중 하 고 Alcian 블루/알리자린 레드 얼룩 이전 프로토콜15수정 절차를 포함.
여기 설명 하는 방법을 상향 또는 하향 치명적인 돌연변이 penetrance 변화는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 골격 돌연변이 고기에 초점을 맞추고, 하는 동안 우리는 모든 돌연변이 제 브라 라인의 축산에 대 한 유용한 전략 될 것입니다 믿습니다. 사실,이 번 식 전략 가능성의 유틸리티 zebrafish 넘어 확장 됩니다. 우리가 예측 penetrance 생물의 광범위 한 범위에서 이동이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 치명적인 penetrance 자손 테스트 하 여 이동 하는 것은 어떤 발달 유전학의 진도 앞으로 밀어 것을 도울 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde, pelleted, solid</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, solid</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Aqueous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Must be from Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide,&amp;nbsp; solid</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; seal</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, solid</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride, solid</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, liquid</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>for DNA quantitation</td></tr></tbody></table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Zebrafish 돌연변이 고기는 수시로 불완전 하 게 침투 하 고, 일부 돌연변이 명시. 일관성 없이 나타나는 재미 있는 고기 공부 하 고, 어려울 수 있으며 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 증가 하 고 감소에 치명적인 zebrafish 골격 돌연변이 penetrance 간단 번 식 패러다임 이다. 치명적인 돌연변이 수 없습니다 선택적으로 사육 될 직접, 때문에 자손 테스트의 고전적인 선택적 번 식 전략 채택 된다. 이 메서드는 또한 Kompetitive 대립 유전자 특정 PCR (KASP) 유전형 zebrafish 및 얼룩 애벌레 zebrafish 연골과 뼈에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 여기에 설명 된 농업 전략 적용 다운스트림 응용 프로그램에 더 많은 결과 재현할 수 있도록 재미 있는 골격 표현 형의 penetrance를 증가할 수 있다. 또한,이 선택적 번 식 전략을 통해 돌연변이 penetrance 감소 가장 결정적인 돌연변이 유전자의 기능을 해야 하는 개발 프로세스를 밝힐 수 있다. 골격은 구체적으로 간주 하지만 여기, 우리는이 방법론은 모든 zebrafish 돌연변이 라인에 대 한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.

이 프로토콜은 장기 축산 기술 이해 zebrafish 골격 돌연변이 (그림 1)에 대 한 유용. 선택적인 breeding 자손을 테스트 하 여 전반적인 penetrance 하향 및 상향 몇 세대 (그림 2)에 있는 변화를 항복 한다. 우리의 이전 작품에서는, 선택적인 breeding의 2 라운드 3117%에서 평균 penetrance 아래로 몰고. 마찬가지로, 우리의 위쪽...

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

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7.5K 조회수.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. 이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

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Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

연구

유전학

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

암 연구학

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

발생학

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

생화학

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

생물학

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

반수체 제브라 피쉬 배아의 생산에 의해<em&gt; 체외</em&gt; 시비

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...