The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

참고 : 전체 과정 동안의 RNase가없는 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 3 &#39;링커 1. Adenylation <ol><li> 뉴 클레아 제 무 H 2 O. 100 μM 3 &#39;라이 게이션 반응을 위해 설계된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 희석 참고 : 올리고 뉴클레오티드는 5 &#39;인산기, 5에서 무작위 뉴클레오티드&#39;끝, 및 3 &#39;dideoxycytosine이 있어야합니다. 5 adenylation 10 &#39;인산기 효율적인 5 M의 효소의 요구 사항이다.&#39; 포스페이트 직접 변형과 폴리 뉴클레오티드 키나아제와 함께 올리고 뉴클레오티드의 예비 처리에 의해 첨가되거나 주문할 수있다. 5 &#39;말단에서 무작위 뉴클레오티드는 특정 최종 끝이 다른 6 이상 반응에 합류하기위한 RNA 리가 제는 전시 순서 기본 설정을 최소화하는 데 중요합니다. 3 올리고 뉴클레오티드 t의 &#39;말단 dideoxycytosine는 (3)에 차단 부재를 배치&#39;오 후속 결찰 단계 동안 링커 링커 concatamers의 형성을 억제하고 또한 연결 반응 (11) (3 &#39;) (3)의 단부에 형성된 miRNA에 링커 분자의 말단&#39;을 차단하는 역할을한다. 다음 편견은 miR-SEQ 방법을 위해 선택된 올리고 뉴클레오티드 링커 서열은 다음 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> 200 pmol의 3 &#39;링커 올리고 뉴클레오티드, 4 ㎕의 10 배 5&#39;DNA의 adenylation 완충액 4 ㎕의 1 mM의 ATP, 4 ㎕의 M의 RNA 리가 제, 뉴 클레아 제 무 H 2 O 40 ㎕의 최종 부피로 다음 adenylation 반응을 조립한다. </li><li> 1 시간 동안 65 ° C에서 반응을 품어. 5 분 동안 85 ° C로 가열하여 반응을 종료합니다. </li><li> 잔류 ATP를 제거하기 위해 미래 반응에서 예상치 못한 결찰 않도록 100 % 에탄올 2.5 볼륨과 10 M 암모늄 아세테이트의 1/3 양을 첨가하여 석출 adenylated 링커. <ol><li> 간단히, 알을 혼합cohol, 소금, 20 분 동안 4 ° C에서의 microcentrifuge에서 최고 속도로 회전 동질성에 올리고 솔루션 (~ 15,000 XG). adenylated 올리고 50 ~ 100 μM을 산출하기 위해 핵산 분해 효소가없는 H 2 O의 적절한 볼륨에 70 % 에탄올, 공기 건조 및 재현 탁에서 펠렛을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 18 % 폴리 아크릴 아마이드 젤을 실행하여 adenylation을 확인합니다. <ol><li> 다음 함께 혼합하여 겔을 준비 : 6.3 g 우레아, 40 % 아크릴 아미드 6.75 ㎖, 10 배 및 1.5 ml의 TBE. H 2 O 15 ML을 추가합니다. </li><li> 우레아가 완전히 용해 될 때까지 혼합하고 암모늄 퍼 설페이트 (APS) 및 15 μL의 tetramethlyethylenediamine (TEMED) (/ V w) 150 μl의 10 %를 추가한다. </li><li> 겔은 1 배 TBE 실온에서 버퍼를 실행하는 겔 폭에 24 V / cm에서 30 분간 사전 실행을 설정하면. 버퍼를 실행 30 분까지되면 플러시 우물. </li><li> 와 adenylated 올리고 뉴클레오티드 및 배 변성 RNA 로딩 버퍼의 동량 (95 % (V / V) 포름 아미드 5 pmol의 혼합0.02 % SDS, 0.02 % 브로 모 페놀 블루 (V / W), 0.01 % (V / W) (W / V) 크실렌 Cyanol, 1.0 mM의 EDTA), 열 간단히 75 ° C, 그리고 얼음에 냉각 스냅. 겔의 우물에 전체 샘플을 분배. 또한 비 adenylated 제어 동량 및 저 분자량 크기 표준을 포함​​한다. </li><li> 브롬 페놀 블루는 젤의 바닥에 방법의 ¾ 때까지 24 V / cm에서 젤을 실행합니다. 1X TBE의 1X SYBR 골드 솔루션 장치, 후 얼룩 젤을 분해하여 UV-transilluminator가 상자 (그림 2)에 시각화. NOTE : 입력 RNA와 샘플에 비해 젤 &quot;은 입력 된 RNA는&quot;컨트롤 PCR 산물의 높은 양으로 생성되지 않은 경우는 상술 한 것과 유사한 방식으로 adenylated 올리고 정제. </li></ol></li></ol> 2. 링커 결찰의 miRNA의 3 &#39;끝으로 <ol><li> 3 &#39;결찰 <ol><li> (W / V) PEG 8000, 0.5 및 1.0 μL 50 % : 나열된 순서대로 얼음에 다음과 같은 구성 요소를 조립# 956; 리터 배 RNA 리가 제 완충액 (500 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 100 mM의의 MgCl 2, 10 mM의 DTT), 1.0 μl의 3 &#39;링커 (100 μM), 0.5 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제, 0.5-8.0 μg의 총 RNA를 adenylated 0.5 ㎕의 T4 RNA 리가 제의 2, 5 μL의 최종 부피로 클레아없는 H 2 O. </li><li> 용액 볼텍스에 너무 점성으로 인해 한번 충분히 혼합 PEG 8000의 고농도 피펫로 반응 믹스 가열 뚜껑 열 사이 클러에 반응 장소. 16 ° C에 블록을 설정하고 4 시간 동안 배양한다. 주 : 반응은 결찰 효율 손실없이 20 μL의 최종 볼륨으로 확장 할 수 있습니다. 주위 온도에서 4 시간 동안 반응 또는 밤새 39 ° C에서 본질적으로 동일 결찰 효율을 얻었다. </li></ol></li><li> 젤 정화 <ol><li> 3 &#39;결찰 후 2 배 RNA 로딩 완충액 동량 반응물을 혼합한다. 5 분 동안 70 ° C로 가열하고, 얼음에 멋진 스냅. </li&gt; <li> PAGE 정제를위한 15 %의 폴리 아크릴 아마이드 겔에 샘플을 실행합니다. <ol><li> 단계 150에서 전술 한 것과 유사한 방식으로, 7 M 우레아를 함유하는 15 % 폴리 아크릴 아미드 겔을 준비한다. </li><li> 적어도 30 분 동안 젤 폭의 24 V / cm에서 젤을 사전 실행합니다. 사전 실행과 동일 전압에서 전원 공급 장치, 세척 우물, 부하 샘플 및 실행 젤을 끕니다. </li><li> 샘플을로드하고 브로 모 페놀 블루가 젤을 종료 단지 때까지 페이지를 실행합니다. 목적 생성물이 크실렌 cyanol 가까이 이동한다. </li></ol></li></ol></li><li> 염색, 시각화 및 절제 <ol><li> 15 분 1X 실행 버퍼 (TBE), 1X SYBR 금, 바위와 깨끗한 트레이에 젤 장치 및 장소 젤을 분해. </li><li> 염색 접시에서 젤을 제거하고 깨끗한 플라스틱 랩으로 덮여 자외선 transilluminator가 박스에 시각화. 결찰 제품의 길이는 약 45 뉴클레오티드해야합니다. </li><li> 깨끗한 razo로 결찰 생성물을 함유하는 영역을 절제0.5 ml의 마이크로 원심 분리 관에 R 블레이드 및 장소. </li></ol></li><li> 제품의 분리 및 침전 <ol><li> 피어스 30 G 바늘 0.5 ml의 microcentrifuge 관의 바닥 및 제 깨끗하고 낮은 유지에 피어싱 튜브를 배치, 1.5 ml의 microcentrifuge 관. ~ 15,000 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 시각적으로 전체 젤 조각이 내부 튜브의 구멍을 통해 이동 한 것을 확인합니다. 필요한 경우, 가까운 구멍에 약간의 젤 조각을 밀어 깨끗한 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 빈 0.5 ML 튜브를 버리고 아크릴 아미드 슬러리에 높은 소금 열 버퍼 400 μL (25 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 0.1 % SDS HSCB 400 mM의 염화나트륨을)를 추가합니다. 4 ° C에서 하룻밤 락 튜​​브 (들). </li><li> 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 0.22 미크론 셀룰로오스 아세테이트 스핀 컬럼에 슬러리를 전송합니다. ~ 15,000 XG에 실온에서 3 분 동안 원심 분리기 멀리 아크릴 아마이드 겔 매트릭스에서 모든 액체를 수집합니다. </li><li> 깨끗하고 낮은 유지에 액체를 이동, 1.5 ml의 튜브 포함20 ㎎ / ㎖ 글리코겐 1 μl를 보내고. 이소프로판올 같은 부피의 1/10 부피의 아세트산 나트륨을 추가한다. 튜브를 수회 반전시켜 용액을 혼합하고 20 분 동안 냉동실 ° C에서 -80 침전. </li><li> 20 분 동안 4 ° C에서 최고 속도로 원심 분리기는 핵산을 펠렛. 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올로 씻는다. 공기 건조 실온에서 10 분 동안 펠릿 5 &#39;결찰 단계로 바로 진행. </li></ol></li></ol> 링커 하이브리드 3. 링커 내고 5 &#39;의 miRNA-3의 끝&#39; <ol><li> 펠렛 핵산, 다음과 같은 구성 요소 추가 : 2 μL PEG 8000 (50 % / W V), 0.5 μL 10 배 RNA 리가 버퍼, 0.5 μL의 ATP (10 mM)을 0.5 μL NN-RNA 올리고 (100 μM) 및 H 4 ㎕의 최종 부피로 2 O. NOTE : 5&#39;-반전 디데 옥시 TCUACAGUCCGACGAUCNN3 다음 &#39;와 제조사에서 HPLC를 통해 정제시켜 같이&#39;NN-RNA 올리고 &#39;의 조성물이다. </li><li> 혼합아래로 반복적으로 피펫 팅에 의해이 샘플. 펠렛 완전히 다시 용해되어 있는지 확인하는 데 시간 (최대 5 분까지)에 대해이 작업을 수행합니다. 다시 용해가 문제가있는 경우 37 ° C에 샘플 잠시 (3-5 분) 가열 혼합 피펫을 다시 시작합니다. </li><li> RNA 분해 효소 억제제 및 T4 RNA 리가 제 1 (5 대)의 1 : 1 혼합물 펠릿을 용액에 다시되면, (1)의 1 μl를 함유하는 깨끗한 PCR 튜브에 콘텐츠를 전송. 다시 피펫 아래로 섞는다. </li><li> 4 시간 동안 37 ° C에서 열 사이 클러에 반응을 부화. cDNA 합성에 바로 진행합니다. </li></ol> 4. 역전사 / cDNA를 합성 <ol><li> 5 다음과 같은 구성 요소를 추가 &#39;결찰 반응 : 2 μL 5 배 RT 버퍼, 0.75 μL 100 mM의 DTT, 1 μL 일루미나 RT 프라이머 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39;(1 μM) 0.5 μL의 dNTPs를 (10 mm)이다. </li><li> 5 분 동안 65 ° C로 피펫과 열에 의해 섞는다. 그런 다음 천천히 벤치 t에 냉각영업 이익. </li><li> 반응물을 얼음에 실온, 도시 튜브로 냉각시키고, 역전사 효소 및 RNA 분해 효소 억제제의 각 0.5 μl를 추가하면. 제조업체의 지침에 표시된 확장 단계에 대한 열 자전거 타는 사람에 피펫 팅 장소로 섞는다. </li><li> 완료되면 추가는 핵산 분해 효소가없는 H 2 O 5 μL 15 μL까지의 cDNA 라이브러리의 최종 볼륨을 가지고 있습니다. </li></ol> 5. 도서관 준비 <ol><li> 인덱싱 PCR를 들어, 얼음에 다음과 같은 반응 조립 : 6 μL 5 배 Phusion 버퍼, 1 μL의 dNTPs를 (10 mM)을 0.9 μL DMSO, 0.75 μL 5 &#39;프라이머 (25 μM), 0.75 μL 3&#39;프라이머 (25 μM) 3 μL의 cDNA 라이브러리 (입력의 양에 따라 가변 농도), 0.5 ㎕의 폴리머 라제 Phusion (1 부), 30 ㎕의 최종 부피로 클레아없는 H 2 O. 템플릿과의 시퀀싱 플랫폼과의 호환성을 보장하기 위해 프라이머 시퀀스를 선택선택. <ol><li> 15 초 동안 72 ° C에서 연장, 제 4 사이클, 3 분 동안 98 ° C에서 초기 변성을 15 초 동안 50 ° C에서 15 초, 어닐링 98 ° C 변성 : PCR을 다음과 같이 설정하여 반응을 실행 . 주 : 입력 재료의 양에 따라, 전체 PCR 사이클 수를 변화. 통상적으로, 총 RNA의 1-2 μg의 입력, 총 13 PCR 사이클은 miR-SEQ 라이브러리를 생성하기에 충분하다. </li><li> 어닐링 및 연장 사이클 합하고 30 초 및 변성을 위해 70 ° C에서 수행되는 두 단계의 방법으로 예를 들어 후속 사이클, 5-12 사이클을 수행해 다시 15 초 동안 98 ° C이다. NOTE은 : 반응 부피는 PCR 프로그램을 일시 정지 허가 및 목적 생성물의 출현을 모니터링하기 위해 미리 결정된 사이클 번호에 10 μl의 분취 량을 제거하기 위해 30 μL이다. 일반적으로, 사이클 10, 13, 및 16은 총 RNA 샘플로부터의 시험을 위해 선택된다. </li></ol></li><li> 준비40 % 아크릴 아미드 2 ㎖, 10 배 TBE 1 ㎖, 및 H 2 O 10 ㎖에 혼합하여 8 % 비 - 변성 아크릴 아마이드 겔. 그런 다음 10 % APS 100 ㎕ 및 TEMED의 10 μl를 추가합니다. 젤을 붓고 설정할 수 있습니다. <ol><li> 30 분 동안 젤 폭의 12 V / cm에서 젤을 사전 실행합니다. 세척 우물. 10 배 로딩 버퍼 1 μL 추가 (15 % 피콜-400, 66 mM의 EDTA, 20 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 0.1 % (w / 블루 / V) 브로 모 페놀 승 V) SDS, 0.01 % (), 10 μl를 추가 치수의 각 웰 5mm X 1mm X 15mm에 샘플. 일반적으로, 각 웰 샘플 30 μL까지 넣을 수 있습니다. 브롬 페놀 블루 염료가 바로 젤의 바닥에서 실행될 때까지 1X TBE 버퍼에 젤 폭의 10 V / cm에서 샘플 젤을 실행합니다. </li><li> 얼룩 단계 2.3에서 기술 된 바와 같이 겔을 시각화. </li><li> 146 염기쌍 밴드를 절제하고 2.4 절에 설명되어있는 것과 유사한 방식으로 HSCB 0.25 ml의 하룻밤 용출. 이소프로판올 같은 부피의 1/10 부피 아세트산 나트륨에서 DNA를 침전. 70 % 전자에 세척 펠렛TE 버퍼에 thanol 및 재현 탁. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 picogreen 사용하여 라이브러리를 정량화. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

본원에 기재된 방법은 결찰 효율, 즉 PEG, 무작위 링커의 사용의 높은 농도, 및 링커 2,6,9 고농도을 최대화하기 위해 여러 주요 변수를 사용한다. 이 방식은 총 RNA 시료 (2)로부터 안정적으로 정량적 시퀀싱 라이브러리를 허용한다. 우리는 입력 RNA의 다수의 적정을 수행하고 선행하는 방법론 (데이터 미기재) 1-8 μg의 범위에서 총 RNA 량에 가장 적합한 것으로 결론 지었다. 10-500 ng의 범위의 양으로 사용하는 경우, 판독 공간의 대부분은 어댑터 concatamers 및 RNA 리가 제를 정제하는 박테리아 서열에 의해 소비된다. 그러나, 그것은 저에이 숫자를 읽 불구하고 동일한 높은 입력 샘플과 비교했을 때 현재 미르 종, 여전히 실제 금액을 반영 이러한 낮은 입력 실험에서 주목할 가치가있다. 위해 총 RNA 샘플에서 관찰 미르 프로필이 실제 반영되도록하려면, 다른 샘플의 반대 심문을 할 수 있도록 양 우리는 정기적으로 세 합성 교정기 RNA를 12의 10 배 희석을 포함한다. 0.01 : 별개의 교정 RNA를 0.001 pmol의 유용한 산출 분석의 양적 특성을 확인하는 번호를 읽고 우리는 0.1의 포함이 있음을 발견했다. 그림 1 (별표 참조)에서 언급 한 바와 같이 합성 올리고 뉴클레오티드는 자주 주문 순서에서 크기가 구분되는 비정상적인 분자를 포함한다. 이러한 제품의 miRNA-3와 공동으로 정화 할 수있는 경우 M의 adenylation 다음 링커 &#39;링커 하이브리드, 다음 페이지에 필요한이 3 정화 할 수있다&#39;를. 우리는이 음성 대조군 샘플에서 관찰 비특이적 인 PCR 생성물의 양을 감소시키는 데 도움이 될 발견했다. 위에서 설명한 방법이 miRNA의 라이브러리 2의 양적 준비를위한 벤치마킹했지만, 우리는 완전히이 응용 프로그램은 쉽게 것을 예상뿐만 아니라보다 일반적인 절차에 licable; 즉 RNA-SEQ와 CLIP-SEQ (크로스 링크 면역 침전) 라이브러리 준비. 사실, 우리는 이전에 발행 된 보고서 (13)에 견고 라이브러리 PCR 대하여 실험 결과-SEQ를 클립을 선행 방법의 동일한 원리의 일부를 사용했다 (데이터는 미도시). 혈청의 miRNAs는 의료 진단 도구로 견인을 얻을 마지막으로, 우리는 위의 방법은 가장 강력하고 신뢰할 수있는 miRNA의 바이오 마커의 식별에 크게 도움이 될 것으로 예상.

높은 처리량 시퀀싱 기반의 방법론은 널리 크게 생물학적 시스템 3,4의 분자 복잡성에 대한 우리의 이해를 확장 최근 몇 년 동안 많은 생물학적 시료에 적용되고있다. 그러나, 높은 처리량 시퀀싱 RNA 샘플의 제조는 종종 이러한 강력한 기술의 잠재 성을 제한하는 고용 방법론에 내재 특정 바이어스를 부여한다. 이 방법은 특정 편견 잘 결찰 기반, 작은 RNA 라이브러리 준비 1,2,5,6- 문서화되어있다. 이러한 편견은 1,000 배의 변화에​​에서 격렬 변수 및 오류가 발생하기 쉬운 시퀀싱 데이터에서 miRNA의 풍요의 추론을, 몰 합성의 miRNA에 대한 숫자를 읽 결과. 파아지 - 유래의 T4 RNA 리가 제의 특성에 초점을 연구 효소는 높은 처리량 시퀀싱 실험에서와 같이 편향된 라이브러리를 나타내 뉴클레오타이드 기반 선호도 7 나타내는 것을 문서화 <s1,2,8&gt;까지. RNA 리가 제에 의해 부여 된 편향을 최소화하기 위하여, 여러 전략이 사용되었다; 거대 분자, 9 군집 결찰 사이트 6 근접한 어댑터 뉴클레오타이드 서열을 랜덤 화하고, 결찰 어댑터 (2)의 높은 농도를 채용. 이 세 가지 방법의 조합을 통해 우리는 높은 처리량 시퀀싱 (그림 1) 호환 작은 RNA 라이브러리의 편견 준비를위한 작업 흐름을 개발했다. 현재의 프로토콜과 우리의 최적화 된 방법 사이의 직접 비교를 위해, 우리의 최근 보고서 2를 참조하시기 바랍니다. 이 최적화 된 방법은 모두 3 &#39;및 5&#39;단계에서 95 % 초과의 결찰 효율을 산출하고, 합성과 생물학적 시료 (2)로부터 소형 RNA 분자의 공평 결찰을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

미르 복제 및 높은 처리량 시퀀싱 미르-SEQ는, 단일 염기 해상도의 miRNAs를 정량화하기 위해 사체 차원의 접근 방식으로 독립적이라고. 이 기술은 miRNA의 분자 3 &#39;, 5&#39;올리고 뉴클레오티드 어댑터를 연결하여 miRNA가를 캡처하고 새로이 miRNA의 검색을 할 수 있습니다. 강력한 차세대 시퀀싱 플랫폼과 커플 링,은 miR-SEQ는 miRNA의 생물학의 연구 수단이되어왔다. 그러나, 올리고 뉴클레오티드 결찰 단계에 의해 도입 상당한 편향 정확한 정량 도구로서 사용되는은 miR-SEQ을 방지했다. 이전의 연구는 현재의 miR-SEQ 방법의 편견은 종종 일부 miRNA가 1,2 1,000 배까지 오류가 부정확 한 miRNA의 정량으로 이어질 것을 보여줍니다. RNA 결찰에 의해 부여 이러한 편견을 해결하기 위해, 우리는 모두 3 &#39;, 5&#39;결찰 단계에 대한 95 %의 결찰 효율성을 초래 작은 RNA 결찰 방법을 개발했다. 이 메신저를 벤치마킹지속적으로 기대 값에서보다 두 배 편차 번호를 읽어 산출, 몰 또는 차등 혼합 된 합성의 miRNA를 사용하여 라이브러리 생성 방법을 입증했다. 또한,이 고효율의 miR-SEQ 방법은 생체 내 총 RNA 샘플 2에서 정확한 게놈 전체의 miRNA의 프로파일 링을 허용한다.

위의 방법에 대한 예상 결과는 처음에 (그림 2) M의 RNA 리가 아제에 의한 adenylation의 대상이었다 DNA 올리고 뉴클레오타이드의 크기의 단일 염기 변화 (증가)의 관찰해야한다. 3 &#39;결찰 후, 아크릴 아미드 겔의 시각화 (도 3 참조) 겔 100-300 뉴클레오티드 영역에서 분명 날카로운 고 분자량 밴드를 나타낸다. 이것은 사용되는 총 RNA 샘플 고품질 인 것을 나타낸다 (악화되지 않음). 둘째 하나는 초과 인 젤의 25 뉴클레오티드 지역에서 매우 밝은 신호, unligated 3 &#39;링커를 관찰해야한다. 또한, (3 &#39;)에 결찰 입력이없는 RNA 제어를 포함하는 것이 도움이 될 수있다. 이는 3 &#39;링커의 순도를 나타내는 것이며, 또한, 비특이적 신호가 문제 될 때 사이클 넘버의 표시에 대한 PCR 단계로 연결되는 실시 할 수있다. 5 &#39;결찰에 대한 진단도 없다그러나도 4에 도시 채용 PEG8000의 고농도의 중요성을 나타내는 무선 표지 된 RNA로 수행 기재된 것과 동일한 반응이다. 마지막으로, PCR 및 천연 PAGE, 확장 된 PCR 프라이머의 서열 어댑터의 크기, miRNA의 삽입, 부가 서열과 일치하는 146 염기쌍의 DNA 생성물이 관찰 될 수있다 후에. 그것은 (경험적으로 결정된다) PCR 사이클의 적절한 수를 초과한다면, 더 miRNA의 인서트 제품 앰플 리콘 원하는 크기를 가릴 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 합성 miRNA의 5 pmole의, 일반적으로 총 RNA 2 μg의에 대한 PCR의 13 ~ 18 사이클이 필요에서 결과는 그림 5에 표시. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig1highres.jpg" /> 2 단계 결찰 작은 RNA 라이브러리 준비를위한 워크 플로우의 그림 1. 도식. S편견은 miR-SEQ 라이브러리의 준비를위한 일반적인 단계는 hown 있습니다. 3 블랙은 표시 &#39;1 단계에서 adenylation 통해 활성화되는 DNA 결찰 어댑터, miRNA의 녹색에 나타내어지고, (3)에 결찰&#39;2 단계에서 어댑터 및 5 &#39;RNA 결찰 어댑터에 결찰되어 청색 인 3 단계 단계 번호에 키메라 분자 프로토콜 부분에 자세히 설명되어 있습니다, 이탤릭체는 효소 단계를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig2highres.jpg" /> 도 2 (3)의 Adenylation 연결 반응 &#39;. 제 M RNA-리가 DNA 올리고 뉴클레오타이드 adenylation에서 18 % PAGE - 우레아 겔 링커 후속 세에 사용되는&#39;(+) (M 번째 RNA 리가 제로 배양 샘플을 나타냄 - ) 샘플은 효소없이 배양하고, (m)이 크기 기준을 가리킴 (숫자 도시기본 쌍의 T 오른쪽). 왼쪽에서 본 올리고 뉴클레오티드 종의 개략도이다. 별표 비정상적인 올리고 뉴클레오티드 합성에 의해 생성 된 큰 DNA 제품을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig3highres.jpg" /> 그림 3. 합성 및 총 RNA 샘플의 3 &#39;결찰. 도 3의 A) 15 % PAGE - 우레아 겔 겔 - 정제 없었던 링커 &#39;결찰 반응, (m)은, 식 (RNA)의 입력이없는 RNA 및 (3)과의 반응을 나타냄 (왼쪽 숫자는 염기쌍을 나타냄) 크기 기준을 나타내는&#39; (+) 같은, 겔 - 정제 된 링커로 라이 게이션 &#39;의 3 실시 마우스 총 RNA의 양을 나타내는 겔 - 정제 하였다 링커, (2, 1 μg의)&#39;5 합성 된 miRNA의 pmol의 및 3 수행 결찰을 나타낸다 , 별표 (*)는 P (32) 수행 결찰 반응 초과 3 &#39;와 유사한 3의 링커. B) Autoradiogram는&#39;표시<html> 5 &#39;합성 miRNA의 한 끝. 상단의 번호는 반응이 진행시켰다 시간 (h)를 나타내고, 하단 unligated 및 결찰의 합계의 비율로 결​​찰 양을 나타낸다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig4highres.jpg" /> 그림 4. 5 &#39;라디오 표지 miRNA에 3&#39;Linker 하이브리드의 결찰. 5 Autoradiogram&#39;결찰 반응은 링커 하이브리드 &#39;합성 miRNA에 3 한 끝&#39;을 P (32) 5 수행. 상단의 번호는 반응에 사용되는 PEG의 양을 나타내고, 하단의 수는 unligated 결찰과의 합의 비율로 결​​찰 양을 나타낸다. miRNA의가, 5 녹색 &#39;및 3&#39;어댑터는 각각 파란색과 검정색 어디에 왼쪽 라인은 결찰 분자의 개략도이다. PLOAD / 52095 / 52095fig5highres.jpg &quot;/&gt; 도 5의 miR-SEQ 결찰 절차에서 생성 된 PCR 제품의 소형 RNA DNA 라이브러리. 8 % 네이티브 PAGE를 PCR이 유래. 상단의 숫자는 PCR의 사이클 측면에서 숫자는 분자 크기 표준을 나타냅니다. PCR에서 각각의 DNA 종은 오른쪽에 식별됩니다. 그리드 패턴은 시편 요리의 자동 형광 때문이다.

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K 조회수.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

연구

생체공학

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

유전학

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>긴 non-coding RNA와 직접적인 RNA-RNA 상호 작용에 관여하는 RNA의 확인

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

긴 non-coding RNA와 직접적인 RNA-RNA 상호 작용에 관여하는 RNA의 확인

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

생화학

AQRNA-seq를 사용한 tRNA 역학 분석

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

저자 스포트라이트: AQRNA-seq의 Role in Mapping Small RNAs and Unraveling Protein Translation Mechanisms (작은 RNA 매핑 및 단백질 번역 메커니즘 규명에서 AQRNA-seq 역할)

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

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높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

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작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

긴 non-coding RNA와 직접적인 RNA-RNA 상호 작용에 관여하는 RNA의 확인

긴 non-coding RNA와 직접적인 RNA-RNA 상호 작용에 관여하는 RNA의 확인

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)