Name: highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
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The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

NOTA: E &#39;fondamentale per mantenere condizioni di assenza di RNasi durante l&#39;intera procedura. 1. Adenylation di 3 &#39;Linker <ol><li> Diluire oligonucleotide DNA progettato per le reazioni 3 &#39;legatura a 100 micron di priva di nucleasi H 2 O. NOTA: L&#39;oligonucleotide dovrebbe avere un &#39;gruppo fosfato, un dinucleotide randomizzato al 5&#39; 5 estremità, e un &#39;dideoxycytosine 3. Il 5 &#39;gruppo fosfato è un requisito dell&#39;enzima Mth per un&#39;efficiente 5&#39; adenylation 10. Il fosfato può essere aggiunto un trattamento preliminare del oligonucleotide con un polinucleotide chinasi, o ordinato con la modifica diretta. Il dinucleotide randomizzato all&#39;estremità 5 &#39;è importante per ridurre al minimo la preferenza che ligasi RNA mostre per certo fine-end giunzione reazioni sugli altri 6 sequenza. Il 3 &#39;dideoxycytosine inserisce un elemento di bloccaggio all&#39;estremità 3&#39; estremità del oligonucleotide to inibire la formazione di concatamers linker-linker durante le successive fasi di legatura e serve anche per bloccare &#39;estremità della molecola miRNA-Linker formato alla fine del 3&#39; la reazione di ligazione 11 3. La sequenza di oligonucleotidi linker scelto per il metodo miR-Seq imparziale è la seguente: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li> Montare la seguente reazione adenylation: 200 pmol 3 &#39;oligonucleotide linker, 4 microlitri 10x 5&#39; tampone adenylation DNA, 4 microlitri 1 mM ATP, 4 microlitri Mth RNA ligasi, priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 40 microlitri. </li><li> Incubare la reazione a 65 ° C per 1 ora. Terminare la reazione mediante riscaldamento a 85 ° C per 5 min. </li><li> Precipitare linker adenylated con l&#39;aggiunta di 2,5 volumi di etanolo 100% e 1/3 volume di 10 M di acetato di ammonio per rimuovere ATP residuo e per prevenire legature imprevisti nelle reazioni future. <ol><li> In breve, mescolare il algnato di alcool, sale e soluzione oligo all&#39;omogeneità, filatura a piena velocità in una microcentrifuga (~ 15.000 xg) a 4 ° C per 20 min. Lavare il precipitato in etanolo al 70%, aria secca, e risospendere in volume appropriato di priva di nucleasi H 2 O per produrre 50-100 micron di oligo adenylated. </li></ol></li><li> Confermare adenylation eseguendo un gel di poliacrilammide al 18%. <ol><li> Preparare il gel miscelando il seguente insieme: 6,3 g di urea, 6,75 ml di 40% acrilammide, e 1,5 ml di 10x TBE. Aggiungi H 2 O a 15 ml. </li><li> Mescolare fino urea è completamente sciolto e aggiungere 150 microlitri al 10% (w / v) di ammonio persolfato (APS) e 15 microlitri tetramethlyethylenediamine (TEMED). </li><li> Una volta che il gel ha impostato, pre-corsa per 30 min a 24 V / cm di larghezza gel con 1x tampone di corsa TBE a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti è da pozzi a filo con tampone di corsa. </li><li> Mescolare 5 pmol di oligonucleotidi adenylated e con uguale volume di tampone di denaturazione 2x RNA di carico (il 95% (v / v) formammide,0,02% (w / v) di SDS, 0,02% blu di bromofenolo (w / v), 0,01% (w / v) Xilene cianolo, 1,0 mM EDTA), portare rapidamente a 75 ° C, e scatto raffreddata su ghiaccio. Dispensare intero campione nel pozzetto del gel. Includere anche un identico ammontare di controllo non adenylated, e gli standard di bassa dimensione peso molecolare. </li><li> Attivare il gel a 24 V / cm fino a quando il blu di bromofenolo è ¾ fino al fondo del gel. Smontare apparecchi, gel post-macchia con soluzione di SYBR-oro 1x a 1x TBE e visualizzare sulla scatola UV-transilluminatore (Figura 2). NOTA: Gel purificare l&#39;oligo adenylated in un modo simile a quello descritto sopra, se &quot;no RNA ingresso&quot; controlli hanno determinato una elevata quantità di prodotto di PCR rispetto ai campioni con ingresso RNA. </li></ol></li></ol> 2. Linker legatura a 3 &#39;Fine di miRNA <ol><li> 3 &#39;legatura <ol><li> Assemblare i seguenti componenti su ghiaccio nell&#39;ordine indicato: 1,0 microlitri 50% (w / v) di PEG 8000, 0,5 &amp;# 956; l 10x tampone RNA ligasi (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 ml adenylated 3 &#39;Linker (100 mM), inibitore della RNasi 0,5 microlitri, 0,5-8,0 mg di RNA totale, 0,5 microlitri RNA ligasi T4 2, priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 5 microlitri. </li><li> Mescolare la reazione pipettando la soluzione è troppo viscoso a vortice causa dell&#39;elevata concentrazione di PEG 8000. Una volta accuratamente miscelati, posizionare la reazione in un termociclatore con un coperchio riscaldato. Impostare il blocco a 16 ° C, e incubare per 4 ore. NOTA: La reazione può essere scalata fino ad un volume finale di 20 ul senza alcuna perdita di efficienza legatura. Reagire per 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per produrre efficienze legatura sostanzialmente identici. </li></ol></li><li> Gel Purificazione <ol><li> Dopo 3 &#39;legatura, mescolare la reazione con un volume uguale di tampone di caricamento 2x RNA. Riscaldare a 70 ° C per 5 min e scatto raffreddare su ghiaccio. </li&gt; <li> Eseguire il campione su un gel di poliacrilammide al 15% per la purificazione PAGE. <ol><li> Preparare un gel di poliacrilammide al 15% contenente 7 M urea, in modo simile a quello descritto in precedenza al punto 1.5. </li><li> Pre-eseguire il gel a 24 V / cm di larghezza gel per almeno 30 min. Spegnere l&#39;alimentazione elettrica, pozzi a filo, campione del carico e gel di corsa a stessa tensione pre-run. </li><li> Caricare il campione e eseguire la pagina fino a quando il blu di bromofenolo è appena uscito il gel. Il prodotto desiderato migrerà vicino al cyanol xilene. </li></ol></li></ol></li><li> Colorazione, visualizzazione, e l&#39;escissione <ol><li> Smontare apparecchi gel e posto gel in vassoio pulito con 1x tampone di corsa (TBE), 1x SYBR-oro, e di roccia per 15 min. </li><li> Rimuovere il gel dal piatto macchie e visualizzare su scatola transilluminatore UV coperta con pellicola trasparente pulito. Il prodotto legatura dovrebbe essere di circa 45 nucleotidi di lunghezza. </li><li> Accise la regione contenente il prodotto con una legatura Razo pulitolama r e il luogo in 0,5 ml di tubo di micro-centrifuga. </li></ol></li><li> Isolamento del prodotto e Precipitazioni <ol><li> Pierce fondo della provetta da 0,5 ml microcentrifuga con un ago da 30 G e posizionare il tubo forato in un secondo pulita, a bassa ritenzione, 1,5 ml provetta. Centrifugare per 5 minuti a ~ 15.000 x g. </li><li> Visivamente che l&#39;intera fetta del gel è spostato attraverso il foro nel tubo interno. Se necessario, usare un puntale pulito per spingere alcuni frammenti di gel più vicino alla buca. </li><li> Smaltire il tubo vuoto 0,5 ml e aggiungere 400 ml di alto contenuto di sale tampone colonna (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) per il liquame acrilamide. Tubo di roccia (s) a 4 ° C per una notte. </li><li> Trasferimento liquami di una colonna di spin acetato di 0,22 micron di cellulosa con un puntale ampio tunnel. Centrifugare per 3 minuti a temperatura ambiente a ~ 15.000 xg per raccogliere tutto il liquido dalla matrice di gel di acrilammide. </li><li> Trasferire il liquido di un ambiente pulito, bassa ritenzione, provetta da 1,5 ml contieneing 1 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Aggiungere un uguale volume di isopropanolo e 1/10 di volume di acetato di sodio. Miscelare soluzione capovolgendo tubo più volte il precipitato in -80 ° C freezer per 20 min. </li><li> Centrifugare a piena velocità a 4 ° C per 20 minuti per far sedimentare l&#39;acido nucleico. Rimuovere il surnatante e lavare in etanolo al 70%. Aria pellet secco per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere direttamente al 5 &#39;passo legatura. </li></ol></li></ol> 3. Linker legatura a 5 &#39;Fine del miRNA-3&#39; Linker Hybrid <ol><li> Per l&#39;acido nucleico in granuli, aggiungere i seguenti componenti: 2 microlitri PEG 8000 (50% w / v), 0,5 ml 10x RNA Ligase Buffer, 0,5 microlitri ATP (10 mM), 0,5 microlitri NN-RNA oligo (100 mM), e H 2 O ad un volume finale di 4 microlitri. NOTA: La composizione del &#39;NN-RNA oligo&#39; è il seguente 5&#39;-invertita dideossi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &#39;ed è stato purificato tramite HPLC dal costruttore. </li><li> Mescolarequesto campione pipettando su e giù più volte. Fare questo per un certo tempo (fino a 5 minuti) per garantire che il pellet è stato completamente ri-solubilizzati. Se ri-solubilizzazione è problematico, riscaldare brevemente campione (3-5 min) a 37 ° C e riprendere pipettaggio mescolare. </li><li> Una volta che il pellet è tornato in soluzione, trasferire il contenuto in una provetta pulita PCR contenente 1 ml di una miscela 1: 1 di inibitore della RNasi e T4 RNA ligasi 1 (5 unità). Anche in questo caso mescolare pipettando su e giù. </li><li> Incubare la reazione in un termociclatore a 37 ° C per 4 ore. Procedere immediatamente alla sintesi del DNA. </li></ol> 4. trascrizione inversa / cDNA Synthesis <ol><li> Aggiungere i seguenti componenti al 5 &#39;reazione Legatura: 2 microlitri di buffer 5x RT, 0,75 ml 100 mM DTT, 1 ml Illumina RT Primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39; (1 micron), e 0,5 microlitri dNTP (10 mm). </li><li> Mescolare pipettando e calore a 65 ° C per 5 min. Poi raffreddare lentamente in panchina top. </li><li> Una volta che la reazione è raffreddata a temperatura ambiente, il tubo posto su ghiaccio e aggiungere 0,5 ml ciascuno di enzima trascrittasi inversa e inibitori RNasi. Mescolare pipettando e posto in termociclatore per la fase di estensione indicato nelle istruzioni del produttore. </li><li> Una volta completato Aggiungere 5 ml di priva di nucleasi H 2 O per portare il volume finale della libreria di cDNA fino a 15 ml. </li></ol> 5. Biblioteca Preparazione <ol><li> Per l&#39;indicizzazione PCR, montare la seguente reazione su ghiaccio: 6 ml 5x Phusion Buffer, 1 microlitri dNTP (10 mm), 0,9 ml di DMSO, 0,75 ml 5 &#39;Primer (25 micron), 0,75 ml 3&#39; Primer (25 micron), biblioteca 3 microlitri di cDNA (concentrazione variabile a seconda della quantità di input), 0,5 ml Phusion Polymerase (1 unità), priva di nucleasi H 2 O per un volume finale di 30 ml. Scegli le sequenze dei primer per garantire la compatibilità con il modello e la piattaforma di sequenziamentoscelta. <ol><li> Eseguire la reazione di PCR con le seguenti impostazioni: denaturazione iniziale a 98 ° C per 3 minuti, per i primi 4 cicli, denaturare 98 ° C per 15 sec, ricottura a 50 ° C per 15 sec, estendere a 72 ° C per 15 sec . NOTA: A seconda della quantità del materiale in ingresso, variare il totale numero di cicli di PCR. Tipicamente, per un ingresso di 1-2 mg di RNA totale, 13 cicli di PCR in totale sono sufficienti a generare la libreria miR-Seq. </li><li> Effettuare cicli successivi, ad esempio, cicli 5-12, in un modo a due fasi in cui i cicli di ricottura e di estensione sono combinati e effettuate a 70 ° C per 30 sec e la denaturazione è ancora 98 ° C per 15 sec. NOTA: Il volume di reazione è di 30 ml per consentire una pausa il programma PCR e rimuovere una aliquota di 10 ml al numero di cicli predeterminati per monitorare l&#39;aspetto del prodotto desiderato. Tipicamente, i cicli di 10, 13, e 16 sono scelti per il test di un campione di RNA totale. </li></ol></li><li> Preparareun 8% non denaturante acrilamide gel miscelando 2 ml di 40% acrilammide, 1 ml di 10x TBE, e H 2 O a 10 ml. Quindi aggiungere 100 ml di 10% di APS e 10 ml di TEMED. Versare il gel e lasciare set. <ol><li> Pre-eseguire il gel a 12 V / cm di larghezza gel per 30 min. Pozzi a filo. Aggiungere 1 ml di 10x tampone di caricamento (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1% (w / v) di SDS, 0,01% (w / v) di blu di bromofenolo), aggiungere 10 ml di campione a ciascun pozzetto di dimensioni 5 millimetri x 1 mm x 15 mm. In genere, ogni bene può caricare fino a 30 ml di campioni. Eseguire il gel campione a 10 V / cm di larghezza gel 1x tampone TBE finché il colorante blu di bromofenolo appena esaurisce il fondo del gel. </li><li> Colorare e visualizzare il gel come descritto al punto 2.3. </li><li> Accise la coppia di banda di 146 base e eluire durante la notte in 0,25 ml di HSCB in modo simile a quanto descritto nella sezione 2.4. Precipitare il DNA in un uguale volume di isopropanolo e 1/10 di volume di acetato di sodio. Lavare pellet nel 70% eTHANOL e risospendere in tampone TE. </li><li> Quantificare la libreria utilizzando PicoGreen secondo le raccomandazioni del produttore. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

La metodologia qui descritta si avvale di diverse variabili chiave per massimizzare l&#39;efficienza di legatura, ovvero alte concentrazioni di PEG, l&#39;uso di linker randomizzati, e alta concentrazione di linker 2,6,9. Questo approccio permette di librerie di sequenziamento in modo affidabile quantitativi di campioni di RNA totale di 2. Abbiamo condotto molteplici titolazioni di ingresso RNA e hanno concluso che il metodo precedente è più adatto per importi totali di RNA nel range 1-8 mg (dati non riportati). Quando si utilizzano quantità comprese tra 10-500 ng, la maggior parte dello spazio di lettura viene consumato da concatamers adattatori e sequenze batteriche da cui i ligasi RNA sono purificati. Tuttavia, vale la pena notare in questi esperimenti di ingresso basse che i miR specie presenti, anche se in basso si legge il numero, sono ancora riflettono importi effettivi rispetto ai campioni di ingresso superiori identici. Per assicurare che i profili miR osservati da campioni di RNA totale sono riflettenti di effettivaimporti, e per consentire interrogatorio di diversi campioni, abbiamo regolarmente includiamo diluizioni 10-fold di tre RNA del calibratore di sintesi 12. Abbiamo trovato che l&#39;inclusione di 0,1: 0,01: 0,001 pmol di RNA calibratore distinte resa utile leggere i numeri per confermare la natura quantitativa del test. Come indicato nella Figura 1 (vedi asterisco) oligonucleotidi sintetici spesso contengono molecole aberranti che sono distinti nella taglia dalla sequenza ordinata. Se questi prodotti sono in grado di co-purificarsi con il miRNA-3 &#39;linker ibrido, allora può essere necessario purificare PAGINA 3&#39; linker seguente Mth adenylation. Abbiamo trovato che questo è utile per ridurre la quantità di non specifico prodotto di PCR osservata in campioni di controllo negativo. Anche se la metodologia sopra descritta è stata benchmark per la preparazione quantitativa delle biblioteche miRNA 2, siamo pienamente anticipiamo che è facilmente applicable per procedure più generali così; cioè RNA-Seq e CLIP-Seq (Cross link Immuno-Precipitazione) preparazione biblioteca. In realtà, abbiamo impiegato alcuni degli stessi principi della metodologia precedente per Clip-Seq esperimenti con conseguente robusta libreria di PCR rispetto ai rapporti precedentemente pubblicati 13 (dati non riportati). Infine, come miRNA sierici guadagnano la trazione come strumento medico diagnostico, prevediamo la metodologia precedente sarà di grande aiuto nella identificazione di biomarcatori miRNA più robusti e affidabili.

Metodologie basate High-throughput sequencing sono stati ampiamente applicati a molti campioni biologici negli ultimi anni notevolmente ampliando la nostra comprensione della complessità molecolare dei sistemi biologici 3,4. Tuttavia, la preparazione di campioni di RNA per high-throughput sequencing conferisce spesso pregiudizi specifici inerenti alla metodologia utilizzata, che limitano la potenziale utilità di queste tecniche potenti. Questi pregiudizi metodo specifico sono stati ben documentati per la base di legatura-piccolo-RNA preparati biblioteca 1,2,5,6. Questi pregiudizi in una modifica di 1000 volte in legge dei numeri per miRNA sintetici equimolari, facendo inferenza di miRNA abbondanza di dati di sequenziamento selvaggiamente variabile e soggetto a errori. Gli studi si concentrano sulle proprietà di T4 ligasi RNA fago-derivati ​​hanno documentato che gli enzimi mostrano preferenze di base nucleotide-7, che si manifestano come le biblioteche di parte negli esperimenti di sequenziamento high-throughput <sup&gt; 1,2,8. Per minimizzare le distorsioni impartite dalla RNA ligasi, molteplici strategie sono state impiegate; macromolecolare affollamento 9, randomizzare la sequenza nucleotidica sull&#39;adattatore che è prossimale al sito legatura 6, e utilizzando alte concentrazioni di adattatore legatura 2. Attraverso una combinazione di questi tre approcci abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per la preparazione imparziale di piccole librerie di RNA compatibili per high-throughput sequencing (Figura 1). Per i confronti diretti tra i protocolli correnti e il nostro metodo ottimizzato, si prega di fare riferimento al nostro recente rapporto 2. Questo metodo ottimizzato produce efficienze di legatura superiore al 95% sia a 3 &#39;e 5&#39; passi e permette la legatura imparziale di piccole molecole di RNA da campioni sintetici e biologici 2.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

Mirna clonazione e high-throughput sequencing, chiamati miR-Seq, si trova solo come un approccio a livello di trascrittoma per quantificare miRNA con risoluzione di singolo nucleotide. Questa tecnica cattura miRNA collegando adattatori 3 &#39;e 5&#39; oligonucleotide alle molecole miRNA e permette la scoperta de novo miRNA. Accoppiamento con potenti piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, miR-Seq è stato determinante per lo studio della biologia miRNA. Tuttavia, distorsioni significative introdotte dal oligonucleotide passi legatura hanno impedito miR-Seq da essere impiegato come strumento di quantificazione accurata. Studi precedenti hanno dimostrato che i pregiudizi in attuali metodi di miR-Seq spesso portano a inesatte miRNA quantificazione di errori fino a 1.000 volte per alcuni miRNA 1,2. Per risolvere questi pregiudizi impartite dalla RNA legatura, abbiamo sviluppato un piccolo metodo di legatura RNA che si traduce in efficienza legatura di oltre il 95% sia per la 3 &#39;e 5&#39; passi legatura. Benchmarking questo imdimostrato metodo di costruzione libreria utilizzando miRNA sintetici equimolare o differenziale misti, produce sempre legge i numeri con deviazione inferiore a due volte rispetto al valore atteso. Inoltre, questo metodo ad alta efficienza miR-Seq permette accurate genome-wide miRNA profiling dall importo totale di campioni in vivo di RNA 2.

I risultati attesi per il metodo precedente dovrebbe inizialmente essere l&#39;osservazione di un solo turno nucleotide (aumento) delle dimensioni del oligonucleotide DNA che è stato oggetto di adenylation da Mth RNA ligasi (Figura 2). Dopo 3 &#39;legatura, visualizzazione del gel di acrilammide indica (vedi Figura 3) taglienti alte bande peso molecolare evidenti nella regione di 100-300 nucleotidi del gel. Ciò indica che il campione di RNA totale utilizzato è di alta qualità (non degradata). In secondo luogo si deve osservare un segnale molto luminoso in corrispondenza della zona 25 nucleotidi del gel, che è in eccesso, unligated 3 &#39;linker. Può anche essere utile includere un controllo non RNA ingresso nella &#39;legatura 3. Questo indica la purezza del linker 3 &#39;, e può anche essere effettuato attraverso il passaggio di PCR per l&#39;indicazione del numero di cicli quando il segnale non specifico diventa problematico. Non c&#39;è diagnostico per la legatura del 5 &#39;Tuttavia mostrato nella Figura 4 è una reazione identica a quella descritta effettuato con RNA radiomarcato che indica l&#39;importanza della concentrazione di PEG8000 impiegato. Infine, dopo la PCR e PAGE nativa, un prodotto DNA di 146 coppie di basi coerenti con le dimensioni delle sequenze adattatore, un inserto miRNA, e la sequenza complementare dei primer PCR estesi possono essere osservati. È importante notare che se viene superato il corretto numero di cicli di PCR (che è determinato empiricamente), il prodotto inserto non miRNA può oscurare la dimensione amplicone desiderato. In figura 5 è un risultato da 5 pmoli di miRNA sintetici, tipicamente per 2 mg di RNA totale sono necessari 13-18 cicli di PCR. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig1highres.jpg" /> Figura 1. Schema del flusso di lavoro per la 2-step legatura piccolo-RNA preparazione biblioteca. Shown sono punti generali per la preparazione di una libreria di miR-Seq imparziale. Mostrato in nero è 3 &#39;adattatore legatura del DNA, che si attiva tramite adenylation al punto 1, miRNA viene visualizzato in verde ed è legatura al 3&#39; adattatore al punto 2, e 5 &#39;adattatore RNA legatura è in blu, che è alla legatura molecola chimerica al punto 3. passi numerati sono descritte in dettaglio nella sezione protocollo, corsivo indicano passaggi enzimatici. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig2highres.jpg" /> Figura 2. Adenylation di 3 &#39;. Linker con Mth RNA-ligasi 18% Urea-PAGE gel adenylation di oligonucleotidi di DNA da utilizzare per la successiva 3&#39; reazione di ligazione, (+) indica campione che è stato incubato con Mth RNA ligasi, (- ) indica campione incubato senza enzimi, e (m) indica le dimensioni standard (numeri visualizzati unt proprio di coppie di basi). A sinistra è una schematica delle specie presenti oligonucleotidiche. L&#39;asterisco indica i prodotti più grandi di DNA generati dal aberrante sintesi oligonucleotidi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig3highres.jpg" /> Figura 3. 3 &#39;legatura di campioni sintetici e Total RNA. A) 15% Urea-PAGE gel 3 &#39;reazioni di ligazione, (m) indica dimensioni standard (numeri a sinistra indicano coppie di basi), (n RNA) indica una reazione senza RNA input e 3&#39; linker che non era gel purificato (+) indica legatura eseguita con 5 pmol di miRNA sintetica e 3 &#39;linker che era gel purificato, (2 e 1 mg) indica la quantità di RNA totale topo sottoposto a 3&#39; legatura con lo stesso, linker gel purificato , asterisco indica eccesso 3 &#39;linker. B) Autoradiogram di simile 3&#39; reazione legatura eseguita con P 32<html> 5 &#39;finire etichettato miRNA sintetici. Numero in alto indica il tempo (ore) la reazione è stata lasciata procedere, e in basso indica la quantità legatura come percentuale della somma dei unligated e legatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52095/52095fig4highres.jpg" /> Figura 4. 5 &#39;legatura di radio-marcato miRNA-3&#39;Linker Hybrid. Autoradiogram 5&#39; reazione legatura eseguita con P 32 5 &#39;estremità etichettata sintetico miRNA-3&#39; linker ibrido. Numero in alto indica quantità di PEG utilizzato nella reazione, e il numero in basso indica la quantità legatura come percentuale della somma dei unligated e legatura. Linee a sinistra sono una schematica delle molecole legatura dove miRNA è in verde, 5 &#39;e 3&#39; adattatori sono blu e nero, rispettivamente. PLOAD / 52095 / 52095fig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. PCR-derivato piccolo RNA-DNA Biblioteca. 8% PAGE nativo dei prodotti di PCR generati dalla procedura di legatura miR-Seq. I numeri in alto indicano cicli di PCR, i numeri a lato indicano gli standard di dimensioni molecolari. Ogni specie di DNA da PCR è identificato a destra. Modello di griglia è dovuto auto-fluorescenza del piatto del campione.

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Views.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Ricerca

Biochimica

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Bioingegneria

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Genetica

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Analisi della dinamica del tRNA con AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autore in primo piano: Ruolo di AQRNA-seq nella mappatura di piccoli RNA e nel disfacimento dei meccanismi di traduzione delle proteine

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicina

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

Riepilogo

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Isolamento di lipoproteine ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

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Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

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Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

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AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

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