Name: cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
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실험실에서 연구 프리츠 - 벤더 재단, 뮌헨, 독일 (TD에)와 (W.-KL에) 위튼 / Herdecke 내부 연구비의 대학 재정 지원된다. 우리는 도움이 제안을 (생리학, 병태 생리 및 독성, 위튼 대학 / Herdecke 연구소) 교수 박사 박사 프랭크 Thévenod에게 감사의 말씀을 전합니다.

시약 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 수정 된 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 준비 (mm 단위 : 136.9 염화나트륨, 5.37의 KCl, 0.34 나 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17의 NaHCO3, pH를 7.2, 아니 페놀 레드). 4 ℃에서 보관. </li><li> 1.5 M CaCl2를 2 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) (pH를 7.2) 증류수 원액 만들기. </li><li> 프로 베네 시드의 250 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. ,, 1 N의 NaOH에 베네 시드 파우더를 녹여 증류수로 최종 부피의 3/4 채우고 천천히 1 N HCl로 pH를 7.4로 적정 유리 산 형태의 경우 (불용성으로 종종 지칭). 4 ℃에서 보관. </li><li> 1mM이 스톡 농도 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 형광 막 투과성 칼슘 결합 염료 녹인다. 어둠 속에서 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> 각 실험에 앞서, 갓 제조 베네 시드를 함유 H하여 BSS 플럭스 (PHF) 버퍼 (최종 농도) 1.5 mM의 염화칼슘 2, 10 mM의 HEPES, pH를 7.2, 5 % 소 태아 혈청, 2 MM의 프로 베네 시드, 및 5.55 mM의 포도당과 HBSS를 수정 결합하는. 37 ° C의 따뜻한. </li></ol> 2. 세포 배양 <ol><li> 표준 배지에서 6 웰 플레이트 또는 35mm 접시의 웰 플레이트 당 2.5 × 10 5 신장 근위 세뇨관 세포 (c12에 WKPT-0293)과 약 70 % 포화 상태에 도달하는 2 일 동안 성장한다. </li></ol> 3. 칼슘 염료로드 <ol><li> 각 웰 또는 접시를 들어, 5 % 소 태아 혈청, 4 μM 세포 투과성 칼슘 결합 염료 및 2 밀리미터 베네 시드를 함유하는 1 ml의 배지를 섞는다. </li><li> 각 웰에 1 ml의 로딩 염료 혼합물과 배양 배지를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 형광 표시기의 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li></ol> Ce의 제 담유동 세포 계측법에 대한 LLS <ol><li> 37 ° C의 따뜻한 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 솔루션입니다. </li><li> 대기음 칼슘 로딩 염료 각 웰의 솔루션과는 우물의 벽을 따라 1 ml의 트립신을 추가합니다. </li><li> 모든 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 품어. </li><li> 1 분 10,000 g에서의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 1.5 ML 튜브 및 펠렛 세포를 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. </li><li> 로 pipetting 아래로 1 ML의 PHF 버퍼에 resuspend을 추가하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 1 분 10,000 g에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 반복 4.6 단계를 반복합니다. 4.7. 또 두 번. </li><li> 500 μL의 PHF 완충액 최종 부피 세포를 재현 탁하고, 1 시간 내에 실험에 셀을 사용한다. </li><li> 선택적 : 카운트 세포는 세포 농도를 결정하고, 5 × 104 사용할 - 측정 당 1 × 105 세포. </li></ol> 5. 흐름 CYT오 미터 설치 <ol><li> , 흐름 cytometer 시작 플루이 딕스 서랍을 열고 시스 유체 탱크의 공기 압력을 증가시키는 통기 밸브 토글 스위치 플립. </li><li> &quot;프라임&quot;내측 튜브 및 유동 챔버 내에서 잠재적 상주하는 공기 방울을 제거하는 기기. </li><li> 유동 세포 계측법 소프트웨어에서 열린 두 점 플롯 창. <ol><li> 첫 번째 점 플롯은 앞으로 각각의 크기와 입도 (granularity)를 통해 시료 내에서 세포의 품질을 제어 할 수있는 Y 매개 변수의 X 매개 변수 및 측면 산란광 (SSC)에 대한 산란광 (FSC)가 필요합니다. </li><li> 제 도트 플롯은 칼슘 - 결합 된 염료의 형광 강도를 측정한다. 리니어 스케일의 X 매개 변수에 대해 초 단위로 로그 스케일와 시간을 사용하여 Y 매개 변수에 대한 적절한 형광 검출 채널을 선택합니다. </li></ol></li><li> &#39;높은&#39;에 유량을 설정합니다. </li></ol> 6. 유동 세포 계측법 M전 측정 <ol><li> RT에서 측정을 수행합니다. 샘플 튜브 (11.5 X 75mm) 유세포에서, 480 μL의 PHF 버퍼를 추가합니다. </li><li> 혼합 20 μL 세포 현탁액 간략하게 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 측으로 튜브지지 암을 이동시키고 기밀 밀봉이 형성 될 때까지 시료 주입 관을 통해 샘플 튜브를 위치. 원래 중심 위치로 튜브 지지대를 돌려줍니다. </li><li> 샘플의 평균 형광 강도가 약 10이 y 축상되도록 형광 채널을 조정하여 측정을 최적화. 저장하고 다음 실험을 위해 사용합니다. </li><li> 실험을 시작하려면, 반복은 6.3에 6.1 단계를 반복합니다. </li><li> 50 초 동안 기록 기준 형광. </li><li> 간단히 추가, 관심, 소용돌이의 화합물을 샘플 튜브를 제거하고 시료 주입 관으로 돌아가 측정을 일시 중지합니다. 이 단계는 15 개 이상의 초를 복용해서는 안된다. </li><li> 측정을 다시 시작하고 204.8 초 총 계속합니다. </li><li> 칼슘 사용 ionophore 같은 이오 노마 이신 (10 μM), 및 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA) 같은 칼슘 킬레이트 제, MnCl 2의 CoCl2 (2 mM)을 각각 양성 및 음성 대조군에 대한. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 이러한 WinMDI (유동 세포 계측법 용 Windows 다중 문서 인터페이스), 스크립스 연구소, 유동 세포 계측법 핵심 시설에 조 트로터가 개발 한 무료 소프트웨어 패키지와 오프라인 분석을 위해 전용 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li><li> SSC와 FSC 매개 변수를 사용하여 도트 플롯을 엽니 다. </li><li> &quot;지역&quot;도구를 사용하여 분석을위한 세포의 지역을 선택 죽은 세포 또는 데이터 분석에서 왼쪽 하단에있는 세포 파편 (그림 1)를 제외 (이미지에 마우스 오른쪽 단추로 클릭). </li><li> 쿼드런트 분석 (그림 2) <ol><li> y 축상의 x 축과 형광 강도에 시간 밀도 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다. </li><li> 우리7.3과 동일한 게이팅 영역 전자. </li><li> &quot;사분면&quot;도구를 사용하여 데이터를 정량화. </li><li> 수직선은 화합물 첨가시에 놓이고 수평 라인이 대조군에서 기준선 형광의 중앙에 위치되도록 사분면 세퍼레이터를 조정. 사분면 구분의 위치가 모든 샘플에서 동일한 지 확인합니다. </li><li> 각 사분면에있는 세포의 비율은 각 모서리 (그림 2)에 표시됩니다. 샘플 사이의 사분면 (UR)를 비교한다. </li></ol></li><li> 히스토그램 분석 (그림 3) <ol><li> y 축상의 x 축 및 이벤트에 대한 형광 강도 히스토그램 창에서 제어 데이터를 연다. 모든 이벤트를 사용합니다. </li><li> 화보 개요, 오버레이 플롯으로 제어 플롯 (파일 → 오버레이 → 파일 열기 → 파일로 이동)에 비교하는 테스트 데이터를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 정량 분석​​의 경우, 하나의 히스토그램은 승리dows 사용해야합니다. 게이트 단계 7.3에서 영역 R1을 사용하여 세포 집단. </li><li> 비 처리 제어에서, 최대 형광 강도의 최소값과 제어 피크의 최대 형광과 끝점 사이 중간 지점에서 시작하는 분석 영역을 표시하기 위해 ( &quot;마커&quot;) 마커 기능을 사용한다. 이 영역에서의 세포의 비율이 계산된다. </li><li> 통계 창에서 데이터를 검색합니다. 분석을 위해 동일한 표시된 영역을 이용하여 데이터 파일을 나머지에 대해 반복. </li></ol></li><li> 형광 강도 분석 (그림 4) <ol><li> y 축상의 x 축과 형광 강도의 시간 도트 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다. </li><li> &quot;속도론 모드&quot;와 &quot;오버레이 속도론 라인&quot;을 사용합니다. 파란색 선은 평균 형광 강도를 나타내는 도트 플롯에 나타납니다. </li><li> 여러 사각형 영역을 만들어 상대 칼슘 유입을 정량화. 각 지역은 아 있어야한다&quot;10 초&quot;에 해당 &quot;50&quot;, 약 idth. 15 사각형 영역을 정의. </li><li> 통계 창에서 정량화를 검색하고 스프레드 시트에 복사합니다. </li><li> 분석을 위해 Y-평균 데이터를 사용합니다. 20 초 50에 해당 R6에 R2의 평균을 계산합니다. 이 기준값이다. </li><li> 칼슘 유입 분석 (발병, 기간 및 강도에 따라 다름)에 대한 적절한 시간 간격을 선택합니다. </li><li> , 평균 기준값이 시간 간격 내에서 상대 100 %로 설정되는 화합물을 첨가 전에 즉, 형광 신호를 각 영역에서의 칼슘 신호를 계산한다. 화합물 첨가를 게시 평균 및 표준 편차의 영역을 결정하고; 이 화합물에 의해 유발 된 평균 칼슘 신호이다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

칼슘은 제 메신저 신호 전달 분자로서, 또한 ER 및 미토콘드리아 사이에서 통신하기위한 수단으로 작용하는 다수의 세포 과정에 키 이벤트이다. 자유 세포질 칼슘 농도의 변화를 측정하는 능력은 세포 생물학의 모든 영역에 적용 할 수있는 유용한 기술이다. 사이토 졸 칼슘 신호를 검출하기위한 다양한 방법이있다. 고전 등의 Fura-2와 같은 칼슘 비율 계량 표시기로부터의 신호는, 형광 촬상 설정 및 절대 칼슘 농도를 이용하여 살아있는 세포에서 모니터링이 최소 및 최대 형광 강도를 결정하는 단계로부터 유도 될 수있다. 그러나,이 기술은 형광 현미경, 설정 생균 이미징 및 분석 소프트웨어와 같은, 특수 장비를 필요로한다. 여기서, 우리는 대부분의 실험실에 액세스 유세포 분석기를 사용하여 부착 성 상피 세포의 시토 졸, 칼슘 검출을위한 간단한 방법을 설명한다. 상피 포에대사, 생체 이물질 및 약물의 수송에 대한 책임을 수송의 배열의 ssession. 특히 중요한 유기 양이온과 유기 음이온 수송 (22)에 속하고,에 SLC22A 상과는, 자사의 회원들 (23)을 사이에 약제 내성 P 당 단백질 ABCB1 및 약제 내성 단백질 (MRPs)를 계산 ATP 결합 카세트 (ATP) 상과, . 게르 겔리 등 알에 의해 종이에 설명 된대로 쥐의 신장 근위 세뇨관 세포 라인 WKPT-0293 c12에를 사용하여 초기 실험을 수행 하였다. (16). 세포 현탁액에 가져오고 FLUO-오전 3시 탑재했다. 그러나, 완만 한 변화는 10 μM의 이오 노마 이신 (사분면 분석에 의해 제어 50.95 % 또는 복수 영역 분석에 의해 1.78 배 대 38.14 %)으로 관찰 하였다. 우리는 상피 운송이 FLUO-오전 3시와 세포의 가난한로드에 대한 책임이 있다는 가설을 세웠다. 이 문제, 프로 베네 시드와 PSC833, 유기의 억제제를 우회하는nion 전송기 및 다 약제 내성 P 당 단백질은 각각 칼슘 세포 단층에 염료를 결합하여 동시에인가 하였다. PSC833 중국 햄스터 난소 세포 (24) 이전의 리포트는 대조적이다 효과, 없었다 반면 기준선 형광 강도의 증가에 의해 지시 된 바와 같이 프로 베네 시드가 염료 로딩 바인딩 칼슘 개선. 이 차이는 아마 다른 세포주 ABCB1의 수준에있다; WKPT-0293 c12에 세포주는 독성 금속 (25), (26)과 같은 유해 물질에 의해 유도 될 수 ABCB1의 낮은 내인성 수준, 항구. 칼슘 염료 로딩을 개선하기 베네 시드의 사용은 예컨대 칼슘 시그널링은 세포 내 신호 전달에 중요한 역할을 할 수있다 신경계, 혈액 - 뇌 장벽 및 간암의 세포와 같은 베네 시드에 민감한 운송 시스템을 나타내는 다른 유형의 세포로 확장 될 수있다 경로. 칼슘의 쉬운 탐지는 requi에 FLUO-3 거짓말에 결합단지 하나의 여기 파장 (506 ㎚) 및 하나의 발광 파장 (525 ㎚)의 별 개로. 그러나, 단파장 칼슘 비 비율 적으로 염료, 염료를 결합하여 생성 된 데이터는, 단지 비 처리 제어 위에 세포질 칼슘의 상대적 증가를 정량화하는데 사용될 수있다. 스펙트럼 변화가 동일하지 않은 염료로드 및 표백의 보정 기능을 결합 칼슘 후에 발생하기 때문에 절대 칼슘 농도를 확인하려면, 비율 계량 염료가 필요하다. 비율 적 염료 인도 1 27,28 유세포하여 면역 세포에서 칼슘 동원의 검출에 사용되었지만, 지금까지,이 상피 세포에서 수행되지 않았다. (칼슘이 결합 할 때 475 nm의 자유 칼슘 때 400 ㎚) Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 절대 세포질 칼슘 농도가 결정될 수있다 UV-흥분성 인도 - 1 개의 발광 스펙트럼을 사용. 우리의 예 데이터는 AP를 유도 약리 화합물을 사용세포질 칼슘 ermanent 변화. 생리 칼슘 신호, 낮은 강도의 아르 빠른 반응 속도를 표시하고 일시적이며, 따라서 문제는 방법 유세포 생리 칼슘 신호를 검출 할 정도로 민감 여부에 남아있다. ATP와 실험 (생균 촬상에 의해 측정 됨) ATP인가시의 증가 된 칼슘 신호에 의해 입증 된 바와 같이 퓨린 수용체를 품고 WKPT-0293 c12에 세포주로 수행 하였다. 100 μM의 ATP, 그러나 복합 첨가가 신호의 일부만이 기록 될 수 있다는 것을 의미 후에 측정을 재개 지연과 결합 된 신호의 급속한 자연 - 사이토, 증가 된 세포 내 칼슘을 1로 관찰 할 수있는 흐름을 사용. 따라서 방법 유세포의 주요 단점은 급속한 (&lt;10 초) 기록하는 제한된 용량 및 과도 칼슘 신호이고; 오히려 방법은 느린 과도 신호 (&gt; 10 초) 또는 영구 상승 석회질을 야기 자극에 더 적합IUM 신호. 이러한 제한은 자극기 농도를 감소시킴으로써 또는 세포질에 방출 된 칼슘을 유지 칼슘 재 흡수 기작 저해제를 적용하지만주의가 사이토 졸 칼슘 자체를 증가하지 않는다 억제제 농도를 선택하도록주의해야 의해 회피 될 수있다. 정보는 라이브 세포 이미징 인수와 흐름 세포 계측법 아주 다르다. 생균 이미징으로 고해상도 칼슘 공간적 변경 이미징 단셀의 세포 내 영역을 선택하여 측정 할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 신속한 칼슘 신호를 기록 할 수 2 초 - 또한, 형광 신호가 논스톱 매 1을 취득한다. 대조적으로, 세포 계측법 느리고 오래 지속 칼슘 신호 더 적합하고 전체 세포 집단에서의 칼슘 신호를 측정 흐른다. 칼슘 신호에 만 상대 변경 방법 유동 세포 계측법으로 정량화 할 수있다. 그러나, 방법은 유동 세포 계측법 ADVAN을 가지고종래 생균 촬상 위에의 tages : 화합물 (자극제 칼슘 신호 전달 억제제의 1) 높은 처리량 스크리닝) 수행 될 수있다; 2) 특정 이미징 전문 지식이 필요하지 않습니다; 3) 연구 기술자는 측정을 수행 할 수 있습니다; 4) 수단을 갖고 있지 않은 임상 및 비 임상 실험실 칼슘 시그널링을 조사 할 수있는 고해상도 이미지 및 칼슘 비율 적 측정을 수행한다. 종합적 방법 유세포은 동역학 조사자가 초기 칼슘 역할을 확립하고자 쉽게 상류와 하류 신호 전달 경로를 결정하는 저해제를 적용 할 수 있다면 생균 이미징이 (칼슘 신호를 특성화하기 위해 요구되는 반면에, 유용 예. 더욱 상세하게, 강도, 공간적 변화). 요약하면, 우리는에 세포질 칼슘 실시간 상대적인 변화의 검출을위한, 간단하고 빠르고 민감한 방법을 서술하기 어려운 부하 부착 신장 상피정지하게되어 세포. 유세포 액세스없이 실험자를 들어,이 방법은 쉽게 큐벳의 셀 서스펜션 spectrofluorimeter에 적용될 수있다.

칼슘은 세포 생리 및 병리 생리 학적 신호 (1)의 전송을 담당하는 중요한 초 메신저. 세포질 칼슘 농도는 칼슘 펌프 및 칼슘 교환기의 활성을 낮게 유지된다. 근질 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA)는 ATP 의존적 방식 모두에서 세포막 칼슘 ATPase를 (PMCA)는 세포 외 구획 칼슘 압출 반면 &quot;펌프 누출&quot;시스템의 일부로서 소포체 (ER) 칼슘 저장소 리필 2. 이러한 호르몬 또는 신경 전달 물질과 같은 생리 메신저, G 단백질 커플 링 수용체, 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 트리 포스페이트 (IP3) (3)를 생성하는 세포막에 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PIP2)을 가수 분해 포스 포 리파제 C의 활성화를 통해 신호를 전송한다. 디아 실 글리세롤은 세포막에 남아있는 반면, IP3은 세포질 내로 확산되어 IP3 수용체에 결합ER 막과 칼슘에서 발견 리간드 칼슘 채널 활성화의 (IP3Rs)는, 세포질 칼슘 농도 4의 증가에서 남중 소포체 내강 저장소에서 해제됩니다. 세포질에 도달하는 칼슘 대체 경로는 세포막에 존재하는 칼슘 채널 교환기 통해서이다. 이 두 구획 사이의 크로스 토크 설명 하였다 : 칼슘에 의한 칼슘의 세포 외 칼슘이 ER 저장 5에서 칼슘 방출을 유도 릴리스 (CICR), 저장이 STIM에 의해 감지 된 ER 저장 비우는 칼슘 항목 (SOCE)를 운영하고 Orai의 개방 원인 세포막에있는 칼슘 채널 ER 저장소 (6)의 재 충진을 촉진. 병태 생리 학적 조건 하에서, 세포 칼슘 응답 생리적 자극 (1)의 부재하에 탈과 사이토 졸 칼슘 증가이다. 칼슘 응답은 다수의 방식으로 영향을받을 수있다 : 칼슘 장기간신호, 세포질에서 칼슘 제거, 칼슘 저장 또는 칼슘의 지역화 변경의 고갈을 지연. 또한, 미토콘드리아는 버퍼링의 중심 역할을 수행하고 칼슘 (7)을 발표. 장기간 및 / 또는 supramaximal 세포질 칼슘 증가는 죽음을 셀에 연결됩니다. 사실, 칼슘보다 종종 셀룰러 병태 생리 학적 반응에 관여하며, 주로 세포 사멸과 관련된 신경 퇴행성 질병, 심장 질환, 암, 골 질환 및 신장 질환과 같은 질병의 광범위한 배열의 키 이벤트하지보다 손실 또는 장기 나 조직 기능 8-10의 변화와. 또한, 칼슘 신호의 섭동 셀룰러 적응 및 세포 기능과 응답의 변화에​​ 연결되었다. 전통적으로, 칼슘 신호는 세포 투과성 아세 (AM) 에스테르 형태로 세포 내로로드 음전하 형광 칼슘 지표로 측정된다. 일단 세포 esteras에 의해 절단ES, 형광 지표 세포 내 구획 내에 남아 칼슘이 결합하면 형광 강도의 증가. 가장 잘 알려진 및 사용 칼슘 표시기는 비율 계량의 Fura-2 로저 첸과 동료 (11)에 의해 개발되고있다. 칼슘 : 서로 다른 친화력과 칼슘 지표는 다른 칼슘 풀을 모니터링 할 수 있습니다. 검출 방법은 살아있는 세포 이미징, 형광 마이크로 플레이트 리더를 포함 유동 세포 계측법. (일반적으로 분 몇 초 이내) 칼슘 신호의 상대적으로 빠른 반응 속도는 칼슘 신호의 특성에 대한 대부분의 정보를 얻는 가장 좋은 방법 이미징 살아있는 세포를 만든다. 이외에도 (밀리 초 이내) 칼슘 신호의 빠른 동역학에서, 생균 이미징은 단일 셀 (12) 내 칼슘 신호 전달의 셀룰러 구획화를 연구하기위한 더 나은 방법이다. 절대 칼슘 농도는 칼슘 산업사의 최소 및 최대 형광을 결정함으로써 계산 될 수있다Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 각각 칼슘 킬레이트 제를 첨가하고 세포를 permeabilizing 의해 icator. 칼슘 신호를 측정하기 위해 유세포의 사용은 제 기회는 막 무결성 및 세포 집단을 분리하고, 단일 파장의 개발과 결합 현탁액 중의 세포의 요건과 같은 여러 파라미터를 측정하는 위치를 면역 세포에서 1980 년대에 개발 된 칼슘 지표는 이상과 convenientdetection 방법 13-15 유동 세포 계측법을했다. 부착 세포에서는 생균 이미징 칼슘 시그널링, 가장 중요한 키네틱 관한 대부분의 정보를 제공하지만, 취득하는 온도 등의 형광 현미경, 관류 시스템, 셀룰러 환경의 유지를 포함하는 복잡한 설정 및 특수 현미경 소프트웨어가 필요 데이터 분석. 이러한 형광 마이크로 플레이트 리더 또는 pharmacol 등의 다른 방법칼슘 킬레이트의 사용을 통해 ogical 수단이 얻은 정보의 측면에서 비교할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 더 넓게, 대부분의 연구에 불구하고 측정이 수행되는 경우에만 최종 점 접착 세포에서 사이토 졸 칼슘을 모니터링하는 데 사용되어 가고있다. 초기 게르 겔리 등의 문헌에 의해 개발 된 방법을 사용. 면역 B 세포 (16)에 실시간 속도론과 유세포 및 샘플 모집단 개별 셀에서 형광 강도를 모니터링하여 세포질 유리 칼슘 농도의 변화가 성공적 경부암 상피 세포에서 측정 된 암 줄기 세포는 17 잡종. 이 방법은 더 칼슘 지표 (18)로드하기 어려운 부착 상피 세포에 사용하기 위해 적응했다. 여기서, 쥐 신장 근위 세뇨관 (c12에 WKPT-0293) (19)의 S1 세그먼트로부터 유도 된 무한 증식 자기편 상피 세포주를 사용하여, 우리는 최적의 간략화를 설명 m유동 세포 계측법에 의해 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 ethod. 많은 상피 세포는 음이온 성 화합물에 대한 유기 운송의 번호를 가지고 있기 때문에, 칼슘 표시기 세포의 로딩은 도전이 될 증명할 수 있습니다. 칼슘 지표, 프로 베네 시드, 페니실린 (20)의 신장 배설을 감소하기 위해 개발 된 원래 원형 유기 음이온 수송의 억제제와의 유출을 방지하기 위해, 배양 매체에 동시에 적용된다. 세포는 칼슘 인디케이터 로딩 단층 유지 화합물 첨가 후 즉시 검출 할 수 현탁액 칼슘 신호로된다.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1241&amp;nbsp;</td><td>Cell permeable</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8761</td><td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td><td>Joe Trotter, The Scripps Institute</td><td></td><td>Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td></tr><tr><td>WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td><td></td><td></td><td>Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &amp;amp; Biophysics, Case&lt;br/&gt; Western Reserve University, Cleveland, OH)</td></tr></tbody></table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

세포질 칼슘을 증가시키기 위해, 두 약물 화합물은 세포 투과성 칼슘 결합 염료, FLUO-3-AM로드 신장 근위 세뇨관 세포 (WKPT-0293 c12에)에 적용되었다. Nontreated 대조 시료는 베네 시드의 존재하에 칼슘 결합 염료로드 된 혼합 그러나 어떤 화합물의 첨가없이 하였다. 쌥시 가르 긴 (TG)는 ER에서 누출로 이어지는 증가 세포질 칼슘의 결과로 SERCA 펌프의 고전적인 억제제이다. Tunicamycin (TUN) 블록 펼쳐진 단백질 반응의 활성화로 이어지는 단백질의 N-당화뿐만 아니라 세포질 칼슘 18,21 증가합니다. 양성 대조군, 이오 노마 이신 (IONO)로서, 세포 외 칼슘 세포막 투과성 만드는 칼슘 이온 운반체를 사용 하였다. 분석을 위해, 세포 집단은 (도 1에 R1) SSC / FSC 도트 플롯에서 지역을 선택하여 게이팅 하였다. 대 시간 형광 강도 대 밀도 플롯은 각각의 데이터 파일을 작성. 사분면 함수를 사용함으로써 도트 플롯 기준선 형광 전과 화합물 첨가 후 위와 아래에 fluo-3 형광 강도를 나타내는 네 부분으로 분리 하였다. 각 사분면의 문이 세포 인구의 비율로 정량화가 증가 세포질 칼슘 농도의 결정을 할 수 있습니다. 이 예에서, 3 μM TG는 칼슘 신호가 유도되었음을 나타내는 사분면 내의 세포의 백분율의 증가를 야기한다. 세포의 비율은 TG 처리 한 세포에서 51.3 % (1.20 배)에 제어에 42.8 %에서 증가한다. 유사하게, 6 μM의 TUN은 49.9 % (1.17 배)으로 증가 칼슘 형광 강도로 세포의 비율을 증대시킨다. 10 μM IONO의 응용 프로그램 오른쪽 상단 사분면에있는 세포 (그림 2)의 65.5 % (1.53 배) 결과. 히스토그램 분석은 1.41 배, 1.36 배와 TG, TUN과 IONO, 각각 (그림 3)으로 2.11 배의 결과 (통계, 참조 &lt;SUP&gt; 18). 마지막으로, 다중 영역 분석 모드를 사용하여, TG, TUN 및 IONO은 1.55 배, 1.29 배 및 각각 제어 (도 4) 위에 칼슘 신호의 4.54 배 증가를 일으켰다. 가장 민감한 분석 모드는 여러 영역 분석했다. 세포 집단의 분포가 정량화 사분면과 히스토그램 분석 모드, 달리, 다중 영역 분석 모드는 전체 세포 집단에서 형광 신호의 변화를 정량화한다. 다른 분석 모드의 결과에서 가장 큰 차이는 여러 지역 분석에서 4.54 배에 사분면 분석 제어를 통해 1.53 배 증가에서였다 이오 노마 이신을 위해이었다. 시험 화합물은 차이를 나타내지 않았다. 절대 값이 상이하지만 그러나 모든 분석 모드에 걸쳐, 칼슘 신호의 범위, 즉, 동일하게 유지 유발, IONO는 TUN TG로하고이어서 큰 효과가 있었다. </p&gt; TG, TUN 또는 IONO의 적용은 세포질 칼슘의 영구적 인 변화를 초래한다. 과도하다 생리 칼슘 신호,이 방법을 사용하여 측정 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 ATP가 WKPT-0293 c12에 세포에 적용 하였다. ATP는 방법 유세포 의해 그 전체에 기록 할 수없는 신속하고 일시적인 칼슘 신호를 유발. 20에서의 ATP 농도 - 100 μM 농도에서는 칼슘 신호를 &quot;느리게&quot;로 감소시켰다 따라서 감지하기 어려웠다. 도 5에 도시 된 바와 같이, 세포질 칼슘의 변화는 5 μM의 ATP의 첨가 후에 측정 될 수있다. 또, 형광 변화의 피크는 기록되지 않았다. 사분면 분석 (도 5b) 및 히스토그램 분석을 사용하여 (도 5C) 모드, ATP 칼슘 신호의 차이로 인해 칼슘 신호의 과도 특성을 검출 할 수 없었다. 그러나, 추적에서 선택한 부분, 여러 rectangulaR 영역 분석 모드 직후에 측정 (도 5a)을 재개 칼슘 신호의 1.85 배 증가를 기록했다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. SSC FSC 도트 플롯 대. 세포 집단의 무결성 측면 스 캐터 (SSC) 및 전방 산란 (FSC)를 사용하여 평가된다. 영역은 추가 분석 (R1)이 선택된다. 광 산란을 감소 죽은 세포와 세포 파편은 제외된다. 대표 도트 플롯이 표시됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 쿼드런트 분석. 염료 로딩 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 칼슘 기준선 형광을 50 초 동안 측정 하였다. 측정 정지 한, 화합물 또는 디luent 첨가, 혼합하여 볼 텍싱 및 측정은 204.8 초 총 즉시 재개 하였다. 정량화가 사분면 분석을 사용 하였다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51857/51857fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3. 히스토그램 분석. TG, TUN 또는 IONO 치료 염료로드 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 칼슘의 히스토그램 플롯. 마커 기능, 제어 곡선의 피크에서 마커의 시작 포인트를 배치하고, 최대 형광에서 끝나는 의해 정량 하였다 높은 칼슘 결합 염료 형광 강도와 게이트 된 세포의 비율을 사용. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51857/51857fig3highres.jpg" target="_blank">larg의 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 어 버전. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig4highres.jpg" width="500" /> 4. 여러 지역 분석을 그림. 염료 로딩 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 칼슘 기준선 형광을 50 초 동안 측정 하였다. 측정은, 화합물 또는 희석제를 첨가하고, 혼합을 중지 텍싱 및 측정은 204.8 초 총 즉시 재개 하였다. 정량화가 여러 사각형 영역 분석을 사용 하였다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51857/51857fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51857/51857fig5highres.jpg" width="500" /> ATP 유도 칼슘 신호의 그림 5. 분석. 기준 형광 O염료 로딩 WKPT-0293 c12에 세포를 결합 F 칼슘을 50 초 동안 측정 하였다. 측정은 5 μM의 ATP를 첨가하고, 혼합을 중지 텍싱 및 측정은 204.8 초 총 즉시 재개 하였다. 데이터는 다수의 직사각형 영역 분석 (A), 사분면 분석 (B) 또는 히스토그램 분석 (C)를 ​​사용하여 정량 하였다. 다중 영역 분석을 위해, 오직 과도 칼슘 신호를 분석 하였다. 대표적인 데이터 또는 n에서 분석 = 3 -. (7)가 표시됩니다 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51857/51857fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K 조회수.  University of Witten/Herdecke.  칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다. 

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a method whereby live-cell flow cytometry is extended upon to analyze the multiple functions of P2X7 receptor activation in real-time. Using a time module installed on a flow cytometer, live-cell functionality can be assessed and plotted over a given time period to explore the kinetics of calcium influx, transmembrane pore formation, and phagocytosis. This simple method is advantageous as all three canonical functions of the P2X7 receptor can be assessed using one machine, and the gathered data plotted over time provides information on the entire live-cell population rather than single-cell recordings often obtained using technically challenging patch-clamp methods. Calcium influx experiments use a calcium indicator dye, while P2X7 pore formation assays rely on ethidium bromide being allowed to pass through the transmembrane pore formed upon high agonist concentrations. Yellow-green (YG) latex beads are utilized to measure phagocytosis. Specific agonists and antagonists are applied to investigate the effects of P2X7 receptor activity. Individually, these methods can be modified to provide quantitative data on any number of calcium channels and purinergic and scavenger receptors. Taken together, they highlight how the use of real-time live-cell flow cytometry is a rapid, cost-effective, reproducible, and quantifiable method to investigate P2X7 receptor function.

Providing single-cell sensitivity, real-time flow cytometry is uniquely suited to quantify multimodal receptor functions of live cultures. Using adult neural progenitor cells, the P2X7 receptor function was assessed via calcium influx detected by calcium indicator dye, transmembrane pore formation by ethidium bromide uptake, and phagocytosis using fluorescent latex beads.

칼슘 유입, 기 공 형성 및 성숙한 신경 조상 세포 수용 체 P2X7에 의해 식 균 작용을 조사 하기 위해 실시간 라이브 셀 Cytometry

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

발생학

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

생물학

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to assess calcium signaling by band-pass flow cytometry. This protocol is designed to measure calcium responses in primary murine T-cells using full spectrum flow cytometry. Total splenocytes are labeled with the ratiometric calcium indicator dye Indo-1, along with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies to cell surface molecules. Leveraging the capabilities of full spectrum flow cytometry provides a platform for utilizing a wide array of cell surface stains in combination with Indo-1. Cells are then analyzed in real-time at 37 &#176;C before and after the addition of an anti-CD3 antibody to stimulate the T-cell receptor. After unmixing the spectral signals, the ratio of calcium-bound to calcium-free Indo-1 is calculated and can be visualized over time for each gated population of splenocytes. This technique can allow for the simultaneous analysis of calcium responses in multiple cell populations.

Calcium influx, a measure of T-cell signaling, is an effective way to analyze responses to T-cell receptor stimulation. This protocol for multiplexing Indo-1 with panels of antibodies directed at cell surface molecules takes advantage of the highly flexible capabilities of full spectrum flow cytometry.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

갓 격리 된 사구체 족 세포의 단일 채널 분석 및 칼슘 이미징

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

<meta charset="utf8"></head><body>채널 활성화 연구를 위한 단세포 칼슘 이미징

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...