Name: technique to collect fungiform (taste) papillae from human tongue
Uploaded: 2010-09-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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이 작품은 NIH R21 DC03969 - 01 (JGB)을 지원했다. 우리는 기술 지원을 그림 4B 씨와 D. 베일리 부인과 S. Alarcon에 표시된 RT - PCR을 수행하기위한 하나의 미뢰 세포 박사 Tauf Huque를 캡처 박사 프리츠 Lischka 감사합니다. M. 야니나 Pepino는 의학의 NIDAT32 DA07313 워싱턴 대학 학교, 세인트 루이스, MO (Cottler, LB PI)에 의해 지원하는 사람입니다.

1. 소개 및 일반 고려 사항 일반적인 절차는 곡선 봄 마이크로를 사용하는 것을 anesthetized 지역에서 fungiform (미각) 용의자의 숫자 (6-8)의 제거 다음에 앞쪽에 혀 등의 표면의 작은 (1cm 2) 영역의 국소 마취를 포함 - 가위 (맥퍼슨 - Vannas 타입 SR # 5603, Roboz, 락빌, MD). 삭제 fungiform 용의자는 약 0.25 mm 3 각 수 있습니다. 각각의 유두와 함께 제거는 거의하지 않는 용의자 (맛) 상피 조직이 있습니다. 새로운 용의자의 3~5주 이후이 지역에 서식하고 (스필맨과 브랜드, 관찰되지 않은) 입맛 기능 회복. 미각 물질이​​ 소량의 제거 후 음식의 맛 또는 풍미에는 눈에 띄는 효과가 없습니다. 성인 인간의 혀를에서 개별 입맛 계산이 연구에서, 그것은 인간 혀 약 5,000 입맛을 포함 것으로 추산하실 수 있습니다. 우리의 절차는 제거이 입맛의 대부분에서 20-25 (평균 ~ 인간 fungiform 유두 당 3.5-4 입맛) 2, 또는 전체의 0.4 % 정도. 또한이 조직의 손실 수술과 관련된 통증은 없습니다. 바늘이 혀를 입력으로 하나, 사출 사이트에서만 약간의 통증 물론, 느낀다. 마취가 없어진 후, 그곳에서 하루도 안되었 가끔 온화한 불편은 있지만 불편함은 할 일이 경험하는 것은 실수로 사람의 혀를 &quot;을 물고&quot;다음보다 훨씬 적습니다. 지난 몇 년간 우리는 마취를 포함하지 않는 대체 절차를 개발했습니다. 조직 제거에 대한 기술은 모두 동일합니다. 프로 시저의 유일한 차이점은 의사가 더 이상 마취가 해결되었습니다 1cm 직경이 영역에 국한되지 않습니다 것입니다. 오히려 S / 그는 유수의 용의자가 나타납니다 혀 등의 표면에 어떤 사이트를 선택할 수 있습니다. 의식과 관련된 통증과 비교하면 제거 용의자의 총수가 제대로 수행하는 경우 또는 마취없이 두 기술에 6-8로 제한됩니다, 6-8 fungiform의 맛을의 용의자를 제거하는 불편이 적은 문제로 간주됩니다 국소 마취를 모두 절차를 받았습니다 개인의 일반적인 조사, 즉,과 마취없이 과목의 압도적 앞으로 모든 biopsies에 국소 마취를하지 않고 분배 것이라고했다. 이 기법 (AIS) 및 마취없이 biopsies을 수행 작성자 가르쳐 여러 동료를 개발 외과 의사들은 자신에 시도하고 불편이 일시적이고 물고 혀를의보다 간주됩니다 증언했습니다. 그들은 마취없이 한 유두의 제거를 시도 기꺼이면 마지막으로, biopsied 수 동의한 개인 수십 묻는 메시지가되었으며 그들이 그들이 마취를 받아야 것이 너무 힘들어하는 판단하는 경우, 모든 않고 용의자의 제거를 계속 동의 마취. 전체 생검 5-10 분 이상 안 걸릴 것입니다. 마취가 고용하는 경우 다른 2~3분이 추가됩니다. 생검은 일반적으로 아침 시간에 수행됩니다. 생검 전에, 자원 봉사자 2 시간 예정 시작 시간 전에 가벼운 식사를 지시하고 있습니다. 생검에서 작성된 정보를 동의가 얻어진다. 생검시 제외 기준 (예를 들어, 모든 위장병 질환, neurodegenerative 질병, 암, 혈액 dyscrasias, 지역 anesthetics에 알레르기 등)보다 큰 심장 박동과 함께들을 약물에 의해 통제 여부와 상관없이 심각한 만성 질환있는 사람을 포함 60 100 이하, 145보다 크거나 100보다 수축기 혈압, 피사체가 연구에 참여할 수있는 90보다 크거나 60보다, 그리고 외과 의사의 의견 diastolic 혈압. 마지막으로, 생검 절차는 우리가 자주 mRNA의 감소 품질의 언급이 같은 조직의 무결성이 빠르게 손실되어 있기 때문에 조직 검사에 대한 처리됩니다 같은 시설에서 수행되어야한다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 문제를 최소화하려면 혀 조직은 가능한 빨리 처리되어야합니다. 2. 제목 준비 <ol><li> 주제는 치과 의자 또는 머리 받침이있는 자리에 앉아있다. </li><li> 생검 당시의 심장 박동과 혈압을 확인합니다. 혈압, 심장 박동이나 구두 능력의 범위 밖의 주제 가을 경우, 의사는 그 / 그녀가 의사를 볼 즉각적인 약속을 그 주제로하는 것이 좋습니다. </li><li> xerostomia, 지리적 혀 또는 혀 병변의 지표에 관심을 가진 일반적인 조직의 건강을 위해 구강 검사. 혀를 병변 또는 xerostomia 포함한 구강 질환의 징후를 보여주는 모든 과목은 연구에서 제외됩니다. 구두 cavit에서 모든 파편을 제거하기 위해 물로 입을 헹굴 수있는 주제를 지시Y. 필요한 경우 혀가 마취 주사를하는 동안 혓바닥으로 진행 될 수 플라크이나 먼지를 제거하는 일회용 혀 scrapper와 세척합니다. 외과 의사는 구강에서 확장으로 혀 앞쪽에 ¼ 잡아 장갑 낀 손에 멸균 거즈 패드를 사용합니다. </li><li> 마취를 사용하는 경우, 28 게이지와 1cc 투베르쿨린 주사기 X 에피네프린 (1:100,000)와 0.25 ML lidocaine (2 %)를 포함하는 ½ &#39;주사 바늘을 천천히 그저 혀 앞쪽에 부분의 지느러미 표면 아래에 하나의 사이트에 주입 . 마취의이 사이트는 이후의 연구와 lidocaine에 의해 간섭을 피하기 위해 수집 사이트에 말초입니다. 비교, 주입 lidocaine의 크기 (0.25 ML)는 일반적으로 치과 절차에 신경 블록 (0.8 ML 1 ML)에 주어진 금액에 대해 분기입니다. 바늘의 삽입 후 있지만 마취의 주입 전에 열망은 혈관이 명중되지 않도록 보장합니다. 그것이 큰 선박이 가까이 등의 표면에 빠진 것으로 해부학적인 몸의 구조 가능성에도 불구하고이주의은 이미 사용 중입니다. 등의 표면에 유일한 동맥은 등의 언어를 구사하는 동맥은 주로 조직의 수확이 발생 앞쪽에 셋째, 더 후부에있는 작은 혈관이있다. 혀의 복부 표면에서 실행되는 큰 언어 동맥과 정맥 언어 훨씬 마취 3 수신 등의 지역에서 삭제되었습니다. 1cm anesthetized 지역은 주변 조직에 비해 약간 옅은 것 같습니다. 이것은 작은 혈관을 압축으로 조직의 붓기 때문이다. 또한 에피네프린의 vasoconstrictive 효과에 의한 것입니다. 1 분 후, 프로브 마비에 대한 영역을 테스트하는 데 사용됩니다. 이 지역은 마비되지 않은 경우, 두 번째 주사 (0.1-0.2 ML)가 주어질 수 있습니다. </li></ol> 3. 텅 용의자를 제거 기술 <ol><li> 피사체의 혀가의 앞쪽에 분기는 (오른손으로 생검을 수행하는 경우) 멸균 거즈로 싸서 (그림 1)과 외과 의사의 왼쪽에서 개최됩니다. 거즈 중 하나 모서리는 외과 의사가 타액 무료로 혀를 닦으 수 있도록 열려 남아 있습니다. 혀는 불필요한 불편을 원인으로하지, 그래서 단단히 개최,하지만 물론해야합니다. 왼손의 검지 손가락의 끝에 직접 생검이 수행되는 사이트 아래에있는 혀 아래에 위치합니다. 상승 검지 손가락을 추진함으로써, 혀 용의자를 쉽게 생검을 위해 스틱 만들기 손가락의 끝에 끌었됩니다. </li><li> 생검에 대한 용의자를 선택하는 기준 : 맛 용의자들은 모양과 크기에 의해 주변 filliform 용의자에서 쉽게 구별할 수 있습니다. Fungiform 용의자는 주변의 원형과 다소 고립됩니다. 그들의 바로 근처에 filliform 용의자 (그림 2A, 파란색 화살표)의 찾아볼 수없는이 원형의 공간이 있습니다. 이 공간은 직경 1mm에 관한 것입니다. fungiform 용의자의 또 다른 특징은 젊은 과목의 대부분 fungiform 용의자 위에 보이는 확장된 모세 arborization입니다. arborization이 위치 fungiform의 용의자는 쉽게하지만, 그들은 유두의 입맛의 존재의 좋은 predictors 반드시 없습니다. 규칙 하나는 프런트 엔드 향해 수확 시작하고 다음 조직 컬렉션의 사이트를 왜곡로부터 모세관 출혈을 피하기 위해 멀리 혀끝에서 움직이면서. </li><li> 일단 좋은 유두는 봄, 마이크로 가위 (맥퍼슨 - Vannas, 곡선, 날카로운 커팅 에지 5mm, 빗, 팁 폭 0.2 mm 전체 길이 3 &quot;(RS - 5603, Roboz) 그것을 클립하는 데 사용됩니다이 확인되었습니다. 효과적으로 마이크로 외과 가위를 사용하려면 하나는 절단을위한 블레이드의 팁을 사용하면 안됩니다; 아니라, 지금까지의 블레이드 내부 (그림 1, 확대 이미지와 그림 3) 가능한 한 가까이 교차 지점에 반대 블레이드와 함께. 유두의 제거는 가위 중 하나가 절단 이동 (그림 1)로 이루어진다. 대상 유두가 나타나는 오픈 블레이드 내부의 추가, 더 효과가 커팅되어 있습니다. 가위의 전반적인 위치가 평행해야한다는 케어 이동해야합니다 혀 등의 표면. </li><li> 때로는 혀가 외과 의사가 제거 유두를 파악하려고으로 건조된다. 일단 건조, 명확하게 fungiform의 유두되는 확인하기 위해 운영자의 능력보다 도전되고 매우 어려운 유두를 통해 날개의 슬라이딩 있습니다. 지나치게 마른 혀는 일반적으로 섬세한 수술 이동이 적은 제어하는​​ 혀에 금속 블레이드 스틱을합니다. 피사체가 그 / 그녀의 입을 닫고 타액은 혀의 표면과 접촉 온시키는 것은 과정을 도와줍니다. 지나치게 서부 유럽 표준시 혀도 좋지 않다. 하나가 혀를 보유하는 데 사용하는 거즈의 모서리를 사용하면이 과정에서 도움이됩니다. </li><li> 발생하는 모든 모세관 출혈은 멸균 거즈로 모래 바닥에 의해 처리됩니다. 보통 출혈하면 몇 분 이내에 중지<html> 백인 군대가 및 추가 조직 수확을 방해하지 않습니다. 용의자는 혀가의 상피 표면 위 확장 및 fungiform 유두만을 상단 4분의 3가 (그림 2B) 제거되기 때문에 입맛을 나타내는 fungiform의 일부는 약간의 출혈이 예상된다. </li><li> 작은 더몬트 포셉을 (패턴 타입)를 사용하여 제거 용의자는 (130 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 1 ㎜ 나 - Pyruvate, 20 MM HEPES - 나 차게 기본 링어 버퍼에 배치됩니다 , 산도 7.2; ~ 305 밀리의 osmols의 osmolality) 이후 조작하십시오. 포셉의 날개 사이에 유두를 꼬집어 절대로 필수적인 그것을 것입니다. 조직은 매우 불안정하고 극단주의해서 다루어 져야합니다. </li><li> 용의자를 제거 후, ​​주제 십년은 15 분 동안 의자에 남아 있습니다. 각 과목들은 anesthetized 혀에 물려하지만, 나머지에 그들의 혀를 유지 말라고합니다. 과목은 시각적으로 참가 외과 의사에 의해 모니터링해야합니다. 마취는 약 30-60분에서 깨어나기 예정입니다. 용의자를 제거 사이트에서 생검 후 약간 아플 수도 있기 때문에, 그들은 매운 곳이나 (온도) 음식, 탄산 음료 또는 중 매우 추운 곳이나 아르 음료 인식하도록 지시하고 있습니다. 추가 표시는 타액의 약간의 붉은 착색 정상이고 응고의 해산시 중단됩니다 과목에 주어집니다. </li><li> 과목은 용의자가 제거되었습니다 사이트의 평가 용의자를 제거 다음 30-40일 볼 수 있습니다. 이 시간 맛이 용의자에 의해 완전히 다시 생성해야한다. </li></ol> 5. 대표 결과 수집 조직은 현장 하이브리드화, 칼슘 이미징, 패치 클램핑 및 조직 문화에 immunohistochemistry, RT - PCR, 사용할 수 있습니다. 제대로 수행하면 용의자의 외관은 직경 0.5-1 mm (그림 2B)에 관한, 흰색을 찾고 건강을하고 있습니다. immunohistochemistry에 대한 수집 용의자는 기존 출판 프로토콜 4에 따라 처리됩니다. paraformaldehide - 고정 맛을 유두에서 전형적인 미뢰은 그림 4A에 표시됩니다. Biopsied의 용의자는 또한 효소 미뢰 세포의 분리를 달성하기위한 5 대우 수 있습니다. 효소 분리 후, 세포는 4C에서 humidified 페트리 접시에 4 시간에 유지하실 수 있습니다. 이 상태에서는 그들은 단세포 PCR (그림 4B), CA - 영상 등을 사용할 수 있습니다 세포 모양의 다양한 사람이 미뢰 세포의 기대처럼 많은 사람들이 슬림 및 바이폴라 (그림 5A 및 5B)되고 표시됩니다. 세포를 수집 또는 CA - 이미징을 수행하면, 현미경으로 약 20 분 후에 세포가 apoptotic blebs (그림 6A 및 6B, 화살표)과 그들의 많은 라운드가 개발을 시작합니다. 그림 5A 및 5B와 같이 우리가 실험실에서 개발한 기술을 사용하여, 세포는 패치 - 피펫을 사용하여 개별적으로 포착했다. 위에서 언급한 바와 같이 용의자는 5~8주 후에 regrow 시작합니다. 그림 7A는 마취를 사용하지 8 fungiform의 용의자가 왼쪽에서 자원 봉사의 혀를 제거되었습니다 혀의 모양을 보여줍니다. 용의자가 해제 냈다되었습니다 여덟 약간의 붉은 반점을 확인할 수 있습니다. 출혈은 수술 후 관찰되지 않습니다. 현재 이미지는 생검 후 10 분 정도 촬영했다. 그림 7B 40 일 생검 후 본 같은 제목의 혀가의 이미지입니다. 모든 용의자를 통지 regrown 있습니다. 재생 용의자가 작동하는지 확인하기 위해 우리는 동일한 용의자와 관련된 두 번째 생검에 동의하는 것으로 간주됩니다 우리의 자원을 물었다. 정확하게 우리가 다시 수확을 계획하고 있던 해당 용의자를 식별하기 위해, 우리는 처음부터 제거 40 일 초기 생검을 게시 후 같은 자원 봉사의 혀를 통해 그것을 겹쳐 있었다 8 용의자에 맞는 그리드를 (7C 그림) 생성 . 혀의 윤곽과 여백에서 격자의 거리로 주었 한번 확인, 우리는 똑같은 용의자를 몇 가지를 제거하고 immunohistochemistry 그들을 처리합니다. 그림 4A이 용의자 중 하나입니다. 미뢰 (노란색)과 제 2 형 맛을 전달 세포 - 관련된 효소 포스 포 라이 페이스 Cβ2 (PLCβ2)에 대한 immunopositive 얼룩의 개요를 확인할 수 있습니다. 이러한 데이터는 여기에 설명된대로 생검 절차를 사용하여 즉, fungiform의 용의자는 장소 가능성이 기능 입맛도가 40 일까지 재생 충분히 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 피사체의 혀가의 앞쪽에 분기는 멸균 거즈로 싸서와 외과 의사의 왼쪽에서 개최됩니다. 텅는 단단히 실시해야합니다. 오른쪽에 확대된 이미지는 가위와 블레이드 관련하여 유두의 위치의 적절한 위치를 보여줍니다. 201/2201fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2. (A) Fungiform 용의자는 파란색 화살표로 표시됩니다. 이들은 다소 그 주변과 인근에 filliform 용의자를 찾아볼 수없는이 원형 공간이있다으로부터 격리 원형 구조입니다. 그것이 제거된 마이크로 가위 초 후에 봄의 끝 (B) Fungiform의 미각 유두. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 자체 거울없이 마취를 사용하여 fungiform의 유두의 생검. 삽입된 페이지는 혀 등의 표면과 평행해야하는 가위의 전반적인 위치를 보여줍니다. 제대로하고 atraumatically 완료하면, 마취가 거의 모든 자원 봉사자에 의해 forgone 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig4a.jpg" alt="그림 4A" /> 그림 4 A. 미뢰의 Immunohistochemistry. fungiform 유두는 포스 포 라이 페이스 β2에 항체를 사용하여 Nomarski 광학에 의해 시각과 레드 형광 단백질 태그. 미뢰 및 몇 가지 표시 맛을 세포의 개요는 노란색으로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig4b.jpg" alt="그림 4B" /> 후보 신맛 수용체의 RT - PCR B., 산성 감지 이온 채널 1 (ASIC1). M = 마커. 4 레인스 1 네 가지 자원 봉사자의 ASIC1에 대한 단세포 RT - PCR되었습니다. 수집 후, fungiform 용의자는 효소 dissociated 있었다 전지는 개별적으로 데리러와 ASIC1 표현 다되었습니다. 레인스 2 4 ASIC1 정상 표현했다. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 되는 하나의 미각 세포의 A. 이미지 패치 피펫을 사용하여 왔어요. 대형 상피 세포는 왼쪽 하단 모서리 (5A)에서 볼 수 있습니다. 두 개의 적혈구가 또한 패치 피펫 위에 유리 통 뒤에 볼 수 있습니다. 미각 세포는 약 30-50 마이크론 길이 약 6 미크론 넓습니다. 참고로, 적혈구 세포는 직경 7-8 미크론에 관한 것입니다. B. 네 개의 상피 세포로 둘러싸인 다른 맛 수용체 세포를 보여줍니다. 미각 세포는 상쾌한 보입니다. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. apoptotic blebs를 (맛 세포, 화살표에 부착된 둥근 blebs 같은 귀신) 개발을 시작 세포의 A. 이미지. 여기에 같이 자신의 외관이 변화하면 B. 전지는 더 이상 수확되지 않습니다. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. 어떤 마취를 사용하지 여덟 맛을 용의자를 제거 후 10 분 A.. 외과 사이트는 약간 붉은 반점으로 볼 수 있습니다. 출혈은이 발견되지 않습니다. 사십일 생검 후 같은 혀를 B.. 모든 용의자가 생성납니다. regrown로 제거 용의자를 식별하기 위해, 그리드는 오른쪽 그림에있는 사이트 만들고 왼쪽 이미지에있는 재생 용의자를 통해 이동했다. C.이 생성 용의자는 동일한 장소에 나타났습니다. 재생 용의자는 (그림 4A 참조) 기능 미각 세포를 포함 것을 보여준 immunohistochemistry 다음이 그룹에서 다시 용의자를 수확.

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	<li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+taste+perception.">Mammalian taste perception.</a> Curr Biol. 26 (4), R148-R155 (2008).</li><li>Miller, I., Doty, R. I., Dekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+peripheral+taste+system.">Anatomy of the peripheral taste system.</a> Handbook of Olfaction and Gustation. , 521-547 (1995).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Figure+12.67.">Figure 12.67.</a> Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , (1995).</li><li>Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+ageusia+in+two+individuals+implicates+ion+channels+of+the+ASIC+and+PKD+families+in+human+sour+taste+perception+at+the+anterior+tongue.">Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue.</a> PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).</li><li>MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I., Spielman, A. I., Brand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+of+taste+cells+in+mouse.">Patch-clamping of taste cells in mouse.</a> Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. , 329-332 (1995).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

인간의 세포를 사용하는 한 가지 주목할만한 장점은 자신의 특이성이다. 상세 여기에서 설명한 절차는 인간의 미각 수용체 세포의 격리를 위해 혀 조직을 제공합니다. 이러한 미각 세포가 미각 정보 전달에 중요한 분자를 발견하려는, 분자 연구에 사용하고, 자극에 맛을 세포 활동을 모니터링 칼슘 이미징 연구. 수 있습니다 또한,이 절차에 의해 제공 혀 조직은 현장 하이브리드화 이러한 immunohistochemistry 등 다양한 기법과 분석, 그리고 실시간 정량 단세포 PCR을 포함하여 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 등 분자 절차에 대한 개별 세포를 캡처 수 있습니다. 이 절차는 그의 감각의 맛을 psychophysically 생검 전에 평가할 수있는 개인에 수행할 수 있기 때문에, 그것은 취향의 이상 (예를 들어, Huque 외를 참조하십시오. 2009 년)을 담당하는 분자 세부 명확한 그림을 얻을 수 있습니다. 이 생검 절차는 입맛의 세포에 풍부한 가능한 및 metabolically 그대로 단세포 준비 생산하기 때문에 이러한 세포에 대한 패치 클램프 녹음을 수행할 수있는 능력을 수 있습니다. 이 기법을 사용하여 미래의 연구는 인간에게 고유한 프로세스뿐만 아니라 질병이나 약물 유발 상태 및 이러한 이상을 치료 regimens을 개발의 미각 이상을 기본 해독 분자 메커니즘 맛을 전달 우리의 이해를 높일 수 없습니다. 마지막으로, 우리의 관찰의 결과는 강하게, 존재 &quot;구멍&quot;자주 fungiform 용의자 가까이 arborizations에 언급 일반적으로 미뢰 모공으로 간주한다는 점입니다 표시, 사실이 아니라 입맛의 존재의 좋은 predictors. 단지 무엇이 구멍의 성격은, 또는 그들이 수행할 수 어떤 기능을, 우리는 몰라요. 우리가이 절차를 시작한 이후 팔년, 우리는 반복 4,000 맛의 용의자를 여러 개 자원 봉사자에서 수집했습니다. 두 불리한 발병률, 국소 마취와 관련된 모두 혀를의 임시 팽창을 주도하지만, 악영향없이 48 시간 안에 해결. 살균 및 atraumatic 조건 하에서 정상적으로 완료하면,이 방법은 안전하고 효과적입니다.

<table><tbody><tr><td>McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3&quot;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5603, Roboz</td><td></td></tr><tr><td>Small Dumont forceps</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4915, Roboz</td><td></td></tr></tbody></table>

technique to collect fungiform (taste) papillae from human tongue

맛의 감각은 인간 생활에 중요합니다. 그것은 잠재적으로 섭취한다 음식의 품질에 대한 본문을 알리고 소화에 대한 영양의 운하를 준비 신진 대사 과정을 자극. 꾸준한 진행 맛을 전달을 (검토를 위해, 브레슬린과 스펙터 2008 1) 기본 초기 생화학 및 분자 이벤트를 이해하는 방향으로 만들어지고있다. 그러나, 현재까지 진행 주로 동물 모델에서 발생했습니다. 수용체의 특이성과 수용체 밀도에 표시된 차이가 종 가운데 다르므 그러나, 인간의 맛을 전달은 인간의 미각 조직을 사용하여 이해합니다. 여기 우리는 입맛을 포함 직경 0.5 mm에 대한 반올림 핑크 앞쪽에 구조로 보이는 인간 fungiform 용의자를 수집하는 생검 방법을 설명합니다. 이러한 biopsied 용의자는 현장 하이브리드화, immunohistochemistry에서 가능한 미뢰 세포의 분리, 그리고 분자 생물학의 기술을 통해 맛을 특정 소설 단백질의 식별을 포함하여 여러 목적으로 사용됩니다.

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Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

gustatory 전달을 기본 분자 메커니즘의 지식은 최근에 크게 인해 동물 모델을 사용하는, 상당한 발전을 즐기고있다. 그러나, 인간의 조직에있는 포유류 영장 연구 중에서 맛이 감도 및 특이성의 넓은 다양성. 우리는 인간의 혀 용의자의 생활 미각 세포를 수집하는 생검 방법을 설명합니다.

인간 혀에서 Fungiform (맛) 용의자를 수집하는 기술

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

28.9K 조회수.  College of Dentistry, New York University. gustatory 전달을 기본 분자 메커니즘의 지식은 최근에 크게 인해 동물 모델을 사용하는, 상당한 발전을 즐기고있다. 그러나, 인간의 조직에있는 포유류 영장 연구 중에서 맛이 감도 및 특이성의 넓은 다양성. 우리는 인간의 혀 용의자의 생활 미각 세포를 수집하는 생검 방법을 설명합니다.

비디오: Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

연구

암 연구학

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

인간 Fungiform의 맛 용의자 전지의 분리 및 문화

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

신경과학

Measuring Oral Fatty Acid Thresholds, Fat Perception, Fatty Food Liking, and Papillae Density in Humans

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty acid receptors housed on taste cells. Previous research has shown that an individual&#39;s oral sensitivity to fatty acid, specifically oleic acid (C18:1) is associated with body mass index (BMI), dietary fat consumption, and the ability to identify fat in foods. We have developed a reliable and reproducible method to assess oral chemoreception of fatty acids, using a milk and C18:1 emulsion, together with an ascending forced choice triangle procedure. In parallel, a food matrix has been developed to assess an individual&#39;s ability to perceive fat, in addition to a simple method to assess fatty food liking. As an added measure tongue photography is used to assess papillae density, with higher density often being associated with increased taste sensitivity.

Oral chemoreception of fatty acids and the association with diet and fatty food preferences may enable the identification of mechanisms involved with the development of obesity and why dietary changes may be difficult for many individuals.

구강 지방산 임계 값, 지방 지각, 지방 음식을 좋아하고, 인간의 용의자 밀도 측정

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Fungiform 용의자 객관적인 분석을위한 덴버 유두 프로토콜

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

맛 시험: 짧고 검증 테스트

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

의학

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 전체 마운트 염색, 시각화 및 분석

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

The article introduces the &#181;Tongue (microfluidics-on-a-tongue) device for functional taste cell imaging in vivo by integrating microfluidics into an intravital imaging window on the tongue.

μTongue: Vivo의 혀를 위한 미세 유체 기반 기능 이미징 플랫폼

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...

생물학

The Tongue and Taste Buds

The surface of the tongue is covered with various small bumps called papillae, which either distribute what has been ingested (filiform papillae) or contain the sensory taste (or gustatory) receptor cells (fungiform, circumvallate, and foliate papillae). Embedded within each taste-related papilla are the taste buds&mdash;clusters of 30 to 100 gustatory receptor cells.

Gustatory receptor cells extend finger-like projections called gustatory hairs (or microvilli) into a region known as the taste pore. Here, many of the cells contain receptors that detect different tastants&mdash;the molecules that can be tasted. The average number of taste buds varies significantly among individuals, with estimates ranging from 2,000-10,000 taste buds. Taste cells have a lifespan of about 10-14 days and are continually replaced. Thus, each taste bud contains taste cells at different stages of development.

<h4>Different Types of Taste Papillae</h4>

Aside from the filiform papillae, which do not contain taste buds, the mushroom-shaped fungiform papillae are the most numerous. Fungiform papillae are predominantly located on the anterior two-thirds of the tongue and contain between one and eight taste buds each.

In contrast, the other two types of papillae&mdash;circumvallate and foliate&mdash;contain more than 100 taste buds per papilla. Circumvallate papillae, the largest type, are located at the back of the tongue in &ldquo;V&rdquo;-like formation. Nearby, on the sides of the tongue, are the foliate papillae.

<h4>The Myth of the Tongue&rsquo;s Taste Map</h4>

The work of many scientists, including Collings, Yanagisawa, and colleagues, indicates that the five basic tastes can be perceived anywhere across the tongue. Thus, distinct tastes are not restricted to particular regions, as typically indicated on tongue maps.

혀와 미뢰

The surface of the tongue is covered with various small bumps called papillae, which either distribute what has been ingested (filiform papillae) or ...

교육

JoVE Core

인간 생물학

감각계

주요 용어 및 개념

Isolation of Circumvallate Papillae (CVP) Epithelium from Mouse Model: An Enzymatic Procedure to Separate CVP Epithelium from Mouse Tongue

After euthanizing an adult mouse, use large sterile dissection scissors to cut the cheeks and break the jaw. Then, lift the tongue and cut the lingual frenulum to separate the tongue from the floor of the oral cavity. Cut the tongue out and collect it in sterile ice-cold dPBS with calcium and magnesium.
Under a dissecting microscope, remove and discard the anterior tongue by cutting just anterior of the intermolar eminence with a razor blade. Then, using a delicate task wipe to remove any hair and excess liquid from the posterior tongue.
Next, fill a 1-milliliter syringe with 200 to 300 microliters of injection enzyme solution and insert a 30-gauge, 1/2 inch needle just above the intermolar eminence until just interior of the circumvallate papillae or CVP. Inject the enzyme solution underneath and at the lateral edges of the CVP between the epithelium and the underlying tissues. Withdraw the syringe slowly and continuously from the tongue as the solution is being injected.
Incubate the tongue in sterile calcium/magnesium-free dPBS at room temperature for precisely 33 minutes. Using extra fine dissection scissors, make small cuts in the epithelium bilaterally and just anterior of the CVP. Then, gently peel the epithelium by lifting it with fine forceps. Once the trench epithelium is free of the underlying connective tissue, place it in a 2-milliliter microcentrifuge tube pre-coated with FBS.