박테리아 성장 곡선 분석 및 환경 응용
Overview
출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
데모 저자: 루이사 이크너
박테리아는 지구상에서 가장 풍부한 생명체 중 하나입니다. 그들은 모든 생태계에서 발견되며 일상 생활에 매우 중요합니다. 예를 들면, 박테리아는 사람들이 먹고, 마시고, 호흡하는 무슨에 영향을 미치고, 포유류 세포 보다는 사람의 바디 내실제로 더 많은 세균성 세포가 있습니다. 박테리아의 중요성 때문에 실험실에서 특정 종의 박테리아를 연구하는 것이 바람직합니다. 이렇게 하려면 박테리아는 순수한 배양에서 통제된 조건하에서 재배되며, 이는 박테리아의 한 종류만 고려중이라는 것을 의미합니다. 박테리아는 순수한 배양에서 빠르게 증가하고, 세포 수는 시간의 짧은 기간에 극적으로 증가. 시간이 지남에 따라 세포 인구 증가의 비율을 측정함으로써, 개발될 "성장 곡선". 이것은 예를 들어 식물 성장을 향상시키고, 독성 유기물의 생분해율을 높이거나, 산업 규모에서 항생제 또는 기타 천연 제품을 생산하기 위해 알려진 수의 세균 분리물을 활용하거나 접종하는 것을 목표로 하는 것이 중요합니다.
Principles
세균성 생식은 1개의 세균성 세포가 분할되고 2개의 세포가 되는 이진 분열을 통해 생깁니다(도 1). 세포 분열에 필요한 시간은 평균 생성 시간 또는 두 배로 증가하는 시간으로 알려져 있으며, 이는 세포 수가 두 배로 증가하는 데 필요한 시간입니다.
그림 1. 지수 세포 분열. 각 세포 분열은 세포 수의 두 배로 초래한다. 낮은 세포 수에서, 증가는 매우 크지 않다; 그러나 몇 세대 후, 세포 수는 폭발적으로 증가합니다. n 분할 후, 2n 세포가 있습니다.
특정 미생물의 성장을 이해하고 정의하기 위해 영양 공급 및 환경 조건이 제어되는 플라스크에 배치됩니다. 액체 매체가 성장에 도움이 되는 성장 및 환경 파라미터에 필요한 모든 영양소를 공급하는 경우, 성장 곡선을 얻기 위한 시간의 함수로 숫자의 증가를 측정할 수 있다. 몇 가지 뚜렷한 성장 단계는 성장 곡선 내에서 관찰될 수있다(그림 2). 여기에는 지연 단계, 기하급수체 또는 로그 단계, 고정 된 단계 및 사망 단계, 각각은 특정 생리적 변화와 연관된다(표 1)를포함한다.
| 단계 | 특성 | ||
| 지연 단계 | 초기 낮은 세포 밀도로 인해 배양 조건에 세포의 생리적 적응 또는 외효소희석으로 인한 성장의 느린 성장 또는 부족. | ||
| 지수 또는 로그 단계 | 평균 생성 시간으로 알려진 개별 시간 간격에서 셀 수가 두 배로 증가하는 최적의 성장 속도. | ||
| 고정 단계 | 성장 (세포 분열) 및 세포의 죽음은 세포 수에 있는 순 증가의 결과로 서로 균형을 조정합니다. 감소 된 성장 속도는 일반적으로 영양소의 부족 및/또는 독성 폐기물 성분의 축적 때문. | ||
| 죽음의 단계 | 사망률은 생존 셀의 순 손실을 초래하는 성장률을 초과합니다. | ||
표 1. 세균 성장의 4 단계.
그림 2. 세균성 인구를 위한 전형적인 성장 곡선. 특히 사망 단계에서 콜로니 형성 단위(CfU)와 광학 밀도를 기반으로 곡선의 모양을 비교합니다. 차이점은 죽은 세포가 여전히 탁도를 초래하지만 문화에서 실행 가능한 식민지를 형성 할 수 없다는 사실 때문입니다.
전반적으로, 액체 배지에 존재하는 세균 세포의 수를 알기 위해 주어진 세균 성 분리에 대한 세균 성장 운동학을 결정하는 것이 종종 중요합니다. 착색 분광계를 이용한 탁도 측정, 직렬 희석 도금 등 액체 매체의 성장을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 탁도 측정은 액체 배지에 존재하는 세포가 많을수록 액체가 더 혼탁된다는 사실에 의존합니다. 직렬 희석 도금은 고체 배양에 실행 가능한 식민지를 형성 할 수있는 액체 배지의 세포의 수를 속이는 것을 포함, 문화의 "식민지 형성 단위"로 알려진 측정. 참고, 그러나, 이러한 도금 분석은 박테리아에 만 사용할 수 있습니다., 사실, 컬터.
Procedure
1. 세균 문화 알리쿼트 컬렉션
- 성장 시간 포인트의 수집 하루 전에, 대장균을가진 50 mL 플라스크에서 트립티 케이스 콩 국물 (TSB) 배지의 20 mL을 접종.
- 27 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이 비교적 긴 잠복기는 대략 109 CFU/mL의 야생 형 대장균의 고정된 상 인구 에 초래됩니다.
- 다음 날, 준비된 배양의 100 μL을 사용하여 TSB의 250mL(500mL 플라스크)를 접종하십시오. 완전히 섞으세요. 5mL 알리쿼트를 제거하고 4°C에서 즉시 냉장 보관하십시오. 이것은 T = 0 또는 T0 시간 지점이며 약 4 x 105 CFU / mL을 포함해야합니다.
- 나머지 대장균(245mL)의 플라스크를 37°C 쉐이킹 인큐베이터에 놓습니다. 매시간 최대 8시간 동안 5mL 의 문화 알리쿼트를 제거하십시오. 각 알리쿼트를 4°C에 저장합니다. T 1부터 T8까지이러한 알리쿼트T를 지정합니다.
2. 직렬 희석
- 냉장고에서 대장균의 알리쿼트를 제거하고 얼음 위에 놓아 운반하십시오. 모든 문화를 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
- 각 대장균 배양(도3)의다양한 희석을 얻기 위해 일련의 희석 튜브를 설정합니다. 마이크로퍼지 튜브는 이 기능에 편리합니다. 각 희석 관에는 희석 액(멸균 식염수)의 900 μL이 있어야 합니다. 각 대장균 배양(T0 ~T8);에대해 희석 시리즈가 필요합니다. 표 2에따라 각 튜브에 레이블을 지정합니다.
그림 3. 대장균도금시술을 보여주는 회로도. - T0의 10-1 희석인 튜브 A에 T 0(초기 대장균 배양)으로 표시된 튜브로부터 대장균의 100 μL을 첨가하여 희석을 시작한다. 5 초 튜브를 소용돌이.
- 이어서,T0의10-2 희석인 식염수, 튜브 B의 다음 튜브에 튜브 A의 100 μL을 추가한다. 각 시간 점 알리쿼트에 대해 필요한 희석 계열을 계속합니다. 전송하기 전에 각 튜브를 소용돌이해야합니다. 각 전송에 새 파이펫 팁을 사용하는 것도 중요합니다.
| 대장균 배양 | 희석 필요 및 튜브 # | ||||||
| A | B | C | D | E | F | G | |
| T0 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T1 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T2 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||||
| T3 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | |||
| T4 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | ||
| T5 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T6 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T7 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T8 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
표 2. 각 대장균 배양에 필요한 희석 계열.
3. 도금
- 표 3에따르면 각 대장균 배양 시간점에 대한 3개의 희석이 도금됩니다. 시점을 가진 라벨 플레이트(T1 ~T8),희석 계수 및 부피가 추가됩니다. 각 희석에 트리플리케이트 플레이트를 사용합니다.
- 각 희석의 100 μL을 한천판의 중앙에 배관하여 접시에 100 μL을 추가한다(도3). 화염 살균 "L" 모양의 유리 막대를 사용하여 즉시 알리쿼트를 퍼뜨리는 행위. 알리쿼트가 즉시 퍼지지 않으면 접시에 앉아 서초기 접종 지점에서 세균과 자라납니다.
- 시간 점 T1에서 T8까지각 희석 계열에 대한 도금을 반복합니다. 플레이트 사이와 특히 다른 희석 사이에 막대를 살균하는 것을 기억하십시오.
- 접시가 몇 분 동안 건조되면, 반전하고 하룻밤 37 °C 인큐베이터에 배치합니다. 판을 반전시키는 것은 천판에 떨어지는 결점을 배제합니다. 하룻밤 동안 잠복한 다음, 접시를 냉장고에 보관해야합니다.
| 대장균 배양 | 도금될 희석제 | ||
| T0 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T1 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T2 | 10-2 | 10-3 | 10-4 |
| T3 | 10-3 | 10-4 | 10-5 |
| T4 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| T5 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T6 | 10-6 | 10-7 | 10-8 |
| T7* | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T8* | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
* 낮은 희석제는 사망 단계로 인해 더 낮은 인구를 고려합니다.
표 3. 대장균 배양을 위한 도금 프로토콜.
4. 식민지 를 계산하고 평균 세대 시간을 계산
- 식민지의 균일성과 오염의 부족에 대한 플레이트를 검사합니다.
- 각 시간 지점(T0 ~T8)에대해 30~300개의 콜로니를 포함하는 희석을 선택하고 삼중판수를 계산합니다.
- 희석 계수를 사용하여, T0~T8을 통해 시간 지점에서 원래 배양의mL당 셀 수를 백계산한다. 예를 들어10-4 희석으로 인한 콜로니 수가 30, 28 및 32인 경우:
식민지의 평균 수 = 30 식민지
이는10-4 희석의 0.1mL에서 발생했습니다.
mL 당 콜로니 수 = 30 x 104 = 3 x 106 - 플롯 로그10 CFU/mL 대 시간(시간).
- 그래프에서 기하급수적 성장 단계를 식별합니다. 지수 성장 단계 내에서 2시간 점과 매번 해당 셀 수를 사용하여 평균 생성 시간을 계산합니다.
Results
직렬 희석 도금 실험에 이어 다음 데이터를 얻었다. 여기에 지정된 기하급수적 성장의 시작 부분에서 시간 t = 0으로 지정되고, 세균 세포의 초기 농도는 1,000 CFU/mL이다. 시간 t = 6 h, 세포의 농도는 16,000 CFU /mL이다.
지금, X = 2n x X0
어디에: X0 = 세포의 초기 농도 = 1,000 CFU/mL
X = 시간 후 세포의 농도 = 16,000 CFU / mL
n = 세대 수
16,000 = 2n x 1,000
2n = 16
로그10 2n = 로그10 16
n x 0.301 = 1.204
n = 1.204 = 4
0.301
4 세대 는 6 h에서 경과, 그래서
평균 생성 시간 = 6/4 = 1.5 h.
그림 4. 질소 고정 박테리아를 포함하는 루트 멍청이.
Application and Summary
배양 배지에서 세균 성장 운동 및 세균 수치에 대한 지식은 연구 및 상업적 관점에서 중요합니다. 연구에서, 그것은 종종 샘플에 박테리아의 수를 알고 중요 하다, 그래서 실험 복제 될 수 있습니다., 필요한 경우, 정확한 동일한 숫자와 함께. 예를 들어, 세균성 이뇨제가 토양 의 플롯에 첨가되는 실험 중에, 독성 유기 토양 오염 물질의 생분해성 향상과 같은 원하는 효과를 얻기 위해 토양 그램당 최소 104 CFU를 첨가해야 합니다. 또 다른 예는 상업적으로 생성된 뿌리 혈관 내분무기의 경우, 알려진 수의 뿌리공포증(식물의 뿌리와 공생관계에 들어가는 박테리아)이 토탄 계 탄소배지(도 4)로함침된다. 배지는 생물학적 질소 고정을 향상시키기 위해 주립 씨앗을 접종하는 데 사용됩니다(즉,분자 질소를 유기 형태로 변환하여 유기체가 영양소로 사용할 수 있음).
성장 운동학은 또한 박테리아의 특정 긴장이 산업 폐기물 또는 기름 오염과 같은 특정 기판을 대사하기 위하여 적응되는지 평가하는 데 유용합니다. 예를 들어, 오일 유출을 정화하기 위해 유전자 조작된 박테리아는 복잡한 탄화수소가 있는 상태에서 재배되어 오일의 독성 효과에 의해 성장이 억압되지 않도록 할 수 있습니다. 유사하게, 산업 폐기물의 혼합물로 자란 박테리아에서 생성된 성장 곡선의 경사와 모양은 박테리아가 특정 물질을 대사할 수 있는지, 그리고 박테리아에 대한 잠재적 에너지원이 폐 혼합물에서 얼마나 많은 잠재적인 에너지원을 발견할 수 있는지 를 과학자들에게 알릴 수 있다.
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