Network Pharmacology and Validation of the Antidepressant Mechanisms of Qiangzhifang in a Chronic Restraint Stress-induced Depression Rat Model

본 연구는 만성 억제 스트레스 유발 우울증의 쥐 모델에서 Qiangzhifan의 항우울 효능을 평가하고 네트워크 약리학 및 분자 도킹 분석을 통해 HIF-1 및 JAK-STAT 경로에 대한 조절 효과를 규명했습니다.

우울증은 심각한 치료가 어려운 복잡한 정신 질환입니다. 중국 전통 의학에서 사용되는 화합물인 치앙지팡(QZF)은 우울증 치료에 잠재적인 임상 효능을 보여줍니다. 그러나 QZF의 작용 메커니즘과 활성 성분은 완전히 규명되지 않았습니다. 이 연구의 주요 목적은 네트워크 약리학 예측과 실험적 검증을 통합하여 우울증 완화를 위한 QZF의 효과적인 활성 성분과 잠재적인 분자 메커니즘을 밝히는 것이었습니다.

만성 억제 스트레스(chronic restraint stress, CRS) 랫트 모델을 채택하고 개방장 검사(open field test, OFT), 자당 선호 검사(sucrose preference test, SPT), 강제 수영 검사(forced swimming test, FST)와 같은 행동 검사를 실시하여 우울증에 대한 QZF의 치료 효과를 평가했다. 행동 매개변수와 관련하여, QZF 그룹은 모델 그룹에 비해 유의하게 높은 체질량, 자당 선호 비율 및 중앙 영역 체류 시간을 보였으며(P < 0.01, P < 0.01, P < 0.01), 강제 수영 테스트에서 고정 시간이 유의하게 감소(P < 0.001). 네트워크 약리학 및 분자 도킹 연구는 QZF가 염증, 신경 보호 및 세포사멸과 관련된 AKT1, IL-6, MTOR 및 TP53을 포함한 주요 표적 유전자와 함께 HIF-1 및 JAK-STAT 경로를 조절함으로써 항우울 효과를 가질 수 있음을 시사합니다. 결론적으로, 본 연구는 우울증의 종합적인 치료를 위한 한약 화합물의 현대화 및 개발에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

전 세계적으로 만연한 건강 문제인 우울증은 지속적인 우울한 기분, 흥미와 즐거움 감소, 인지 및 신경학적 장애를 특징으로 합니다¹. 세계보건기구(WHO)의 보고에 따르면 우울증은 전 세계적으로 약 3억 8천만 명에게 영향을 미치며 이 수치는 증가할 것으로 예상됩니다². 우울증은 복합적이고 복합적인 정신 장애로서 환자의 삶의 질에 영향을 미치고 높은 발병률, 재발률,^{장애율 3}을 특징으로 하는 사회에 상당한 경제적, 의학적 부담을 안겨줍니다.

우울증의 원인은 복잡하며, 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았다. 이 분야의 연구가 진행됨에 따라 신경 염증, 산화 스트레스 및 세포사멸과 같은 요인이 상당한 관심을 받고 있습니다. 연구에 따르면 우울증 환자는 건강한 사람에 비해 TNF 및 인터루킨-1β와 같은 전염증성 사이토카인 수치가 높으며, 염증성 질환이 있는 환자에서 우울증 유병률이 더 높은 것으로 관찰된다⁴. 산화 스트레스에서는 유해한 자극에 대한 반응으로 활성산소종(ROS)이 과도하게 생성되어 신체의 항산화 방어를 압도하고 산화 시스템과 항산화 시스템 간의 불균형을 초래하여 조직 손상을 유발합니다. 우울증 시 산화 스트레스가 높아지면 지질 과산화가 촉진되고 세포 유전자 및 단백질의 손상이 악화되어 신경 기능에 영향을 미치고 신경 세포 변성, 세포사멸 및 가소성 손상에 기여할 수 있다⁵. 또한, 우울증 환자의 임상 양상, 생화학적 마커 및 뇌 구조에서 관찰된 변화는 세포사멸과 관련이 있습니다. 영상 연구에 따르면 우울증 환자에서 해마 부피 감소와 위축이 있으며, 신경 세포 사멸(neuronal apoptosis)이 이러한 변화에 중추적인 역할을 할 수 있습니다⁶.

현재 약물 치료는 우울증을 관리하기 위한 주요 접근법이며, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI)와 노르에피네프린 재흡수 억제제(NRI)가 임상 실습에서 자주 사용되고 있다⁷. 그러나 이러한 약물은 심각한 부작용을 동반합니다. 두통과 불면증과 같은 중추신경계 증상 외에도 대부분의 항우울제는 메스꺼움과 설사를 포함한 위장 부작용을 흔히 나타낸다 ^8,9. 일부 항우울제는 성기능 장애를 유발할 수도 있으며¹⁰, 이는 치료 결과에 심각한 영향을 미치고 우울증 환자의 복약 순응도를 감소시킨다¹¹. 더욱이 일부 환자에게는 이러한 약물의 효능이 제한적입니다. 최근의 대사체학 연구에 따르면 장내 미생물총(microbiota)의 개인차가 약물 효능에 영향을 미칠 수 있다고 한다¹². 따라서 더 안전하고 효과적인 치료법의 개발은 우울증 연구에서 중요한 초점으로 남아 있습니다.

전통 한의학(Traditional Chinese medicine, TCM) 제제는 여러 성분, 표적 및 경로를 포함하는 시너지 효과로 인해 우울증 치료에 상당한 잠재력을 입증했습니다¹³. TCM은 활발한 양의 기(楊)가 신체의 활력을 유지하는 데 필수적이라고 주장합니다. 따라서 Yuanqing Ding 교수는 한의학의 진단 및 치료의 고유한 원칙과 광범위한 임상 경험을 활용하여 "yang yu shen tui"가 우울증의 근본적인 발병 기전이라고 제안했습니다. 이 개념을 바탕으로 그는 이 발병기전을 구체적으로 다루기 위해 Qiangzhifang (QZF)을 개발했습니다¹⁴. 우울증 치료에 QZF를 임상적으로 적용한 결과, 총 71.43%¹⁵의 효과율로 상당한 효능이 입증되었습니다. QZF는 Ramulus cinnamomi (gui zhi, GZ), Polygala tenuifolia (yuan zhi, YZ), Alpinia oxyphylla miq (yi zhi ren, YZR), Paeonia lactiflora (bai shao, BS), Fritillariae cirrhosae bulbus (chuan bei mu, CBM), Panax ginseng (ren shen, RS), Rhodiola rosea L (hong jing tian, HJT) 및 감초 (gan cao, GC) (보충 파일 1). 연구에 따르면 Polygala tenuifolia 는 사포닌이 풍부하고 신경 보호 효과를 나타냅니다¹⁶. 이와 유사하게, Ramulus Cinnamomi-Paeonia lactiflora 허브 쌍은 통증과 우울증을 완화하는 데 잠재적인 효능을 입증했다¹⁷. 또한, 인삼의 총 사포닌은 해마의 전염증성 사이토카인 수치를 감소시키고, 우울 행동을 개선하며, 쥐의 해마 신경 손상을 약화시킬 수 있다¹⁸. 감초는 주로 트리테르페노이드와 플라보노이드를 함유하고 있습니다. 감초의 총 플라보노이드(LF)는 우울 행동을 개선하고, BDNF/TrkB 신호 경로를 조절하며, 시냅스 가소성을 향상시킴으로써 항우울 역할을 할 수 있습니다¹⁹. 그러나 QZF의 항우울 효과의 기저에 있는 특정 메커니즘은 불분명하여 광범위한 적용이 제한됩니다.

따라서 본 연구는 CRS 우울증 쥐 모델을 확립하고, 행동 실험을 통해 쥐의 우울증에 대한 QZF의 치료 효과를 입증하고, 네트워크 약리학 및 분자 도킹 기술을 사용하여 QZF의 항우울 기전을 체계적으로 평가하는 것을 목표로 한다²⁰. QZF의 활성 구성 요소와 잠재적 대상을 명확히 함으로써 우울증의 핵심 대상을 정확하게 찾을 수 있습니다. 우리는 QZF의 작용 기전을 깊이 탐구함으로써 우울증 환자에게 더 안전하고 효과적인 치료 옵션을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 우울증 치료에 TCM을 적용할 수 있는 과학적 근거를 제공할 수 있다고 믿습니다.

모든 실험 프로토콜은 산둥 중국 전통 의학 대학의 동물 실험 윤리 위원회(승인 번호: YYLW2023000327)의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드를 준수했습니다. 이 실험에서는 평균 체중이 (140 ± 10) g인 SPF 등급의 건강한 수컷 Wistar 쥐 40마리를 사용했습니다(그림 1). 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비 및 소프트웨어 목록은 재료 표를 참조하십시오.

1. 쥐 우울증 모델

1. 동물 사육 및 그룹화
   1. 동물들과 함께 사육장에 들어가 꼬리 표시 도구를 사용하여 번호를 매깁니다.
   2. 쥐를 케이지에 개별적으로 수용하고 21 ± 2 ° C의 온도와 12 시간 / 12 시간의 라이트 / 다크 사이클을 유지합니다.
   3. 실험실에서 7일 동안 쥐를 적응시키고, 음식과 물을 즉흥적으로 접근하면서 적응을 위해 매일 쥐를 다루십시오.
   4. 적응 기간이 끝나면 체중을 측정하고 자당 선호도 테스트(SPT) 및 개방 필드 테스트(OFT)를 수행합니다.
   5. 실험 데이터를 기반으로 쥐를 4개의 그룹으로 나누고 각 그룹이 대조군(CON) 그룹, 모델(CRS) 그룹, QZF 그룹 및 플루옥세틴(F) 그룹의 10개 쥐로 구성되도록 합니다.
2. CRS(Chronic Restraint Stress) 랫트 모델 수립
   1. 쥐 억제 장치를 구성합니다. 쥐의 크기²¹에 적합한 지름과 길이의 투명 플라스틱 튜브를 선택하여 쥐가 탈출을 막으면서 서서 내부를 돌릴 수 있도록 합니다. 전기 납땜 인두 구멍 펀처를 사용하여 플라스틱 튜브의 측면과 뚜껑에 구멍을 만들어 적절한 공기 순환을 보장합니다.
   2. 부드럽게 약물의 매일 위내 투여 후 1 시간 구속 장치에 쥐를 배치, 편안한 위치에 있는지 확인.
   3. 억제 기간 동안 모든 그룹의 쥐에게 음식과 물을 박탈하십시오. 구속 기간이 끝나면 충분한 음식과 물을 균일하게 공급하십시오. 일일 구속 시간을 6시간(9:30부터 15:30시간까지)으로 고정하고 연속 28일 동안 유지하십시오.

2. 약물 개입

1. 위를 통해 투여: 용액 1mL/체중 100g, 플루옥세틴(2.7mg·^kg-1·^day-1) 및 QZF(2g·^kg-1·^day-1)²². 그룹 C 및 CRS에 단일 변수 제어를 위해 등가 수직 식염수를 제공합니다.
   참고: 일일 약물 투여는 08:00시에 수행되었으며, 모델 수립과 동시에 시작되어 28일 모델링 기간 동안 지속되었습니다.

3. 자당 선호도 테스트(SPT)

1. 실험이 시작되기 24시간 전에 쥐에게 음식과 물을 주지 마십시오.
2. 1% 수성 자당 용액을 준비하고 용액과 순수한 물을 실험 동물의 음료수병에 채워 무게를 잰다. 실험 전후에 병의 무게를 측정하여 순수한 물과 자당수의 소비량을 측정합니다.
3. 각 쥐 케이지 덮개의 물 섭취구에 자당 용액 한 병과 순수한 물 한 병을 왼쪽과 오른쪽에 하나씩 놓으면 무료로 마실 수 있습니다. 쥐가 물을 섭취하기 위해 한쪽을 선호하지 않도록 실험 시작 30분 후에 물병의 위치를 왼쪽과 오른쪽으로 바꾸십시오.
4. 실험 1 시간 후 모든 물병을 제거하고 즉시 무게를 측정하고 자당 용액과 순수한 물의 소비량을 기록하십시오. 다음 공식을 사용하여 주간 자당 선호도 비율을 계산합니다.
   자당 선호도 값 = × 100%

4. 체중 측정

1. 실험실에 들어올 때 매주 쥐의 무게를 측정하고 오전 7:00에 고정된 무게 측정 시간을 설정합니다. 체중 변화를 쉽게 관찰할 수 있도록 이 일정을 수립하십시오.

5. 오픈 필드 테스트(OFT)

1. 실험을 시작하기 전에 1시간 동안 쥐를 행동실에 적응시키고 열린 필드 상자의 조명을 조정하여 균일한 분포를 보장합니다. 추적 소프트웨어에서 쥐가 명확하게 보이는지 확인하십시오.
2. 비디오 추적 및 분석 시스템을 활용하여 개방형 필드 상자(50cm x 50cm x 50cm)의 바닥 표면을 9개의 동일한 면적 정사각형 그리드로 나눕니다. 벽에 인접한 8개의 그리드를 주변 영역으로, 중앙 그리드를 중앙 영역으로 지정합니다.
3. 열린 필드 상자의 중앙 영역에 쥐를 놓습니다. 비디오 추적 시스템을 사용하여 5분 동안 쥐의 움직임을 기록합니다.
4. 각 쥐를 테스트 한 후 75 % 에탄올로 챔버를 청소하여 잔류 냄새를 제거하고 다음 쥐의 행동에 방해가되지 않도록합니다. 열린 필드 활동의 총 거리(mm)와 OFT 레코드의 중앙 그리드에 있는 항목 수를 입력합니다.

6. 강제 수영 시험(FST)

참고: 쥐 강제 수영 실험은 사전 실험과 공식 실험으로 구성됩니다. 공식 실험 24시간 전에 동일한 절차에 따라 쥐를 15분 동안 수영하면서 사전 실험을 수행합니다.

1. 실험 동물들이 환경에 적응할 수 있도록 실험 시작 최소 30분 전에 행동실로 데려갑니다.
2. 투명한 원통형 플렉시 유리 물 실린더 (높이 50cm, 지름 20cm)를 준비하고 23-25 ° C에서 물을 채 웁니다. 동물의 체중에 따라 수심을 조정하여 동물의 꼬리가 실린더 바닥에서 일정 거리를 유지하도록 합니다.
3. 쥐를 천천히 물통에 넣고 실험이 진행되는 동안 조용히 하세요. 카메라 및 신호 수집 시스템을 활성화합니다. 300초 이내에 떠 있는 부동성의 지속 시간을 관찰하고 기록합니다. 즉시 물에서 쥐를 제거하고 실험이 끝나면 말리십시오.
4. 각 세션이 끝나면 다음 쥐에게 영향을 미치지 않도록 물을 교체하십시오.

7. 네트워크 약리학적 예측

1. QZF 화합물 및 추정 표적 수집
   1. Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) 데이터베이스(https://old.tcmsp-e.com/)²³, HERB 데이터베이스²⁴ 및 TCMID 데이터베이스(https://www.bidd.group/TCMID/)에 액세스합니다. GZ, YZ, YZR, BS, CBM, RS, HJT, ZGC를 포함한 QZF의 8개 TCM 이름을 키워드로 사용하여 허브의 활성 화합물 및 표적을 검색합니다. TCMSP 및 스위스 목표 예측(http://www.swisstargetprediction.ch/)에서 목표를 수집합니다. 필터 값을 확률*> 0으로 설정합니다.
      참고: 일반적으로 성분은 약동학적 특성에 따라 활성 성분으로 포함되었습니다: 경구 생체이용률(OB) ≥ 30%, 약물 유사 특성(DL) ≥ 0.18²⁵.
2. 질병 표적 예측
   1. GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org/)에서 키워드 "우울증"을 검색하고, 우울증과 관련된 유전자 표적을 얻고, 질병 표적의 전자 스프레드시트를 다운로드하고, 평균값보다 높은 유전자 점수를 필터링하고, 우울증 표적 목록을 작성한다²⁶.
3. 약물-성분-질병-표적 네트워크
   1. 새 스프레드시트를 만들고 동일한 열에 우울증 관련 목표와 약물 목표로 채웁니다. 메뉴 표시줄에서 시작을 클릭합니다 | 조건부 서식 | 셀 강조 표시 규칙 | 중복된 값. ²⁷이 나타나는 대화 상자에서 형식(예: "연한 빨강 채우기")을 선택하고 확인을 클릭하여 결과를 봅니다.
   2. 네트워크 분석 소프트웨어를 실행하고 메뉴 표시줄에서 File(파일)을 클릭하여 스프레드시트 파일을 가져옵니다. 가져오기 | 회로망. 왼쪽 제어판에 있는 Style 패널에서 노드의 크기와 색상을 조정하여 네트워크의 모양을 최적화합니다. 네트워크 토폴로지 분석을 수행하려면 메뉴 표시줄에서 Tools(도구)를 클릭합니다. 네트워크 분석²⁷.
4. 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크
   1. Jvenn (https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html) 도구에 액세스하고, 화합물 표적과 질병 표적을 별도로 업로드하고, 화합물 추정 표적과 질병 표적 사이의 중복 유전자(OGE)를 플롯합니다. 이미지에서 숫자를 클릭하고 스프레드시트에 복사하고 벤 다이어그램 이미지를 다운로드합니다.
   2. STRING 데이터베이스(https://stringdb.org/⁾²⁸에 액세스하고 스프레드시트의 OGE를 데이터베이스에 입력합니다. 특히 QZF anti-depression overlapping target list를 List of Names 대화 상자에 붙여 넣습니다. Organisms 섹션에서 Homo sapiens를 선택하고 SEARCH | 계속을 클릭합니다. 제목 표시줄에서 내보내기 옵션을 선택하고 PNG 및 TSV 형식²⁹로 PPI 네트워크의 요약 테이블을 다운로드합니다.
5. 핵심 단백질 스크리닝
   1. 네트워크 분석 소프트웨어(https://cytoscape.org/)를 시작합니다. 그런 다음 메뉴 표시줄에서 File(파일) | 가져오기 | 네트워크 | 이전 단계에서 생성된 TSV 포맷 파일을 가져오는 파일⁽³⁰).
   2. 메뉴 표시줄에서 Analyze Network(네트워크 분석 )를 선택하고 Analyze(분석 ) 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 분석 결과를 보고 노드의 수, 가장자리의 수, 평균 정도와 같은 네트워크의 전반적인 구조적 특성을 이해합니다.
   3. 앱 | 메뉴 표시줄의 앱 관리자. MCODE를 검색하고, 플러그인을 설치하고, 플러그인을 실행하여 허브 대상을 가져옵니다. 그런 다음 CytoNCA를 검색하고, 플러그인을 설치하고, 차수(Degree), 근접성 중심성(CC) 및 매개성 중심성(BC)의 세 가지 매개 변수 값에 초점을 맞춥니다. 이러한 매개변수의 값에 따라 일반적으로 핵심 단백질로 간주되는 더 높은 Degree, CC 및 BC를 가진 노드를 스크리닝합니다³¹.
6. 유전자 온톨로지(GO) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 농축 분석
   1. 생물정보학 플랫폼(https://www.omicshare.com/)을 엽니다. 도구 메뉴를 클릭하고 ID 유전자 변환 도구를 찾아 클릭합니다. 그런 다음 파일 업로드 버튼을 클릭하고 타겟 유전자의 코어에서 생성된 단계를 선택한 후 변환된 파일 ID 목록을 다운로드합니다.
   2. 도구 메뉴에서 Dynamic KEGG enrichment Analysis 도구를 클릭합니다. 유전자 ID 목록을 업로드합니다. Species 옵션에서 Homo sapiens를 선택하고 Submit 버튼을 클릭합니다.
   3. Tools 메뉴에서 Dynamic GO enrichment Analysis 도구 | 유전자 옵션 | 파일 업로드 옵션을 선택합니다. 유전자 ID 목록을 선택하고 종 옵션에서 호모 사피엔스를 선택합니다. 생물학적 과정(Biological Process), 분자 기능(Molecular Function) 및 세포 성분(Cellular Component)을 포함한 분석을 위한 GO 유형을 선택합니다.
   4. KEGG 및 GO 농축 분석 결과의 경우 필터링 임계값 을 p < 0.05로 설정합니다. 카운트를 내림차순으로 정렬합니다.

8. 분자 도킹 검증

1. PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 웹 사이트를 방문하십시오. 검색창에 대상 화합물을 입력합니다. 2D 구조를 클릭하고 다운로드합니다.
2. PDB(https://www.Rcsb.org/) 데이터베이스를 엽니다. 고분해능을 가지며 원래 리간드를 포함하는 결정 구조를 선택합니다. PDB 파일을 다운로드합니다.
3. 단백질 구조를 최적화하려면 분자 시각화 소프트웨어를 엽니다. 다운로드한 PDB 파일을 로드합니다. 물 분자를 제거하고 최적화된 PDB 파일을 저장합니다.
4. 분자 도킹 소프트웨어를 열고 최적화된 PDB 파일을 가져옵니다. AutoDockTools에서 Edit(편집) | 물 삭제 : 물 분자를 삭제합니다. Edit( 편집)를 클릭합니다. 수소 첨가 | 단백질과 리간드에 수소 원자를 첨가하기 위해 첨가²⁹.
5. AutoDockTools에서 리셉터 바를 receptor.pdbqt로 설정하고 리간드 바를 ligand.pdbqt로 설정합니다. pdbqt를 엽니다. 파일을 사용하여 단백질과 리간드의 결합 부위를 확인하고 수용체 단백질과 리간드 화합물을 완전히 둘러쌀 수 있도록 도킹 박스의 크기와 위치를 설정합니다. AutoDockTools에서 그리드 | 그리드 상자를 정의하여 상자의 중심 좌표와 치수를 설정하고 분자 도킹에 기본값을 사용합니다. 도킹 프레임은 결합 에너지의 내림차순으로 자동으로 정렬됩니다.
6. 결과 파일을 열고 최적의 결합 에너지 값을 기록합니다. 결합 에너지가 낮을수록 결합이 더 안정적임을 나타냅니다. 분자 시각화 소프트웨어를 사용하여 결과 파일을 로드합니다. 리간드-수용체 상호 작용을 명확하게 표시하도록 보기와 색상을 조정합니다.

9. 통계 분석

1. 과학 데이터 분석 및 시각화 소프트웨어에서 통계 분석을 수행하고 모든 데이터를 SEM± 평균으로 나타냅니다. 약물 투여 전과 후의 그룹 간 비교를 위해 반복 측정 양방향 ANOVA를 사용합니다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용하여 세 개 이상의 그룹 간의 비교를 수행합니다.
2. P < 0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

CRS에 의한 쥐 우울증 모델의 행동 테스트 결과

자당 선호도 테스트 결과
기준선에서는 그룹 간의 자당 선호 계수에 차이가 없었습니다(P > 0.05). 28일간의 개입 후 CRS 그룹의 자당 선호 계수는 CON 그룹(P < 0.05)보다 유의하게 낮았으며, F 및 QZF 그룹은 CRS 그룹(둘 다 P < 0.01)에 비해 유의하게 높은 계수를 보였습니다. 그 결과, 스트레스를 받은 쥐는 전형적인 쾌락증 증상을 보였으며, 이는 F 및 QZF 치료로 완화되었습니다(그림 2A).

체중 결과
CRS 유도 전에는 그룹 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다(P > 0.05). 4주간의 스트레스 후 그룹 CRS의 체중 증가율은 그룹 CON보다 현저히 낮았으며(P < 0.01), 그룹 F 및 QZF는 그룹 M보다 유의하게 높은 성장률을 보였다(P < 0.001, P < 0.01). 이러한 결과는 스트레스가 쥐의 정상적인 생리적 신진대사를 방해했으며, F 및 QZF 그룹은 비정상적인 대사 프로필에서 상당한 개선과 수정을 보였다는 것을 나타냅니다(그림 2B).

오픈 필드 테스트 결과
28일간의 개입 후 4개 그룹(P > 0.05) 간에 개방 필드 테스트의 총 거리에는 유의한 차이가 없었습니다(그림 2D). 그룹 CON과 비교하여 그룹 CRS의 중앙 영역에서 소요되는 시간이 유의하게 감소했습니다(P < 0.01). CRS 그룹과 비교하여 F 및 QZF 그룹의 중앙 영역에서 보낸 시간은 크게 증가했습니다(둘 다 P < 0.01). 치료군 간에는 유의한 차이가 없었다(P > 0.05)(그림 2C,E).

강제 수영 테스트 결과
중재 28일 후, CRS 그룹은 CON 그룹에 비해 부동성 시간이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(P < 0.0001). CRS 그룹에 비해 F 및 QZF 그룹은 부동성 시간이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다(P < 0.05, P < 0.001)(그림 2F).

네트워크 약리학 예측

복합 가정이 있는 대상 네트워크
QZF-화합물-가상 타겟 네트워크를 구축하기 위해 먼저 QZF의 가상 타겟 1,020개를 스크리닝한 후 네트워크 분석 소프트웨어를 통해 복합 타겟으로 수집 및 시각화했습니다. 네트워크는 1,184개의 노드와 8,728개의 엣지를 보여주었습니다(그림 3)³².

QZF 및 우울증 표적 스크리닝
GeneCards 데이터베이스에서 총 17,947개의 우울증 관련 표적을 검색했으며, 평균 관련성 점수는 1.105였습니다. 관련성 점수가 1.105(n = 5,048)를 초과하는 대상은 이후 추가 데이터 분석을 위해 선택되었습니다. 612개의 공통 표적(OGE)을 얻기 위해 QZF에서 1,020개의 표적으로 벤 다이어그램을 구성했습니다(그림 4A). 분석을 위해 612개의 공통 대상을 STRING 데이터베이스로 가져왔고, PPI 네트워크에는 607개의 노드와 14,375개의 에지가 포함되었으며(그림 4B), 상호 작용 네트워크를 얻기 위해 OGE를 네트워크 분석 소프트웨어로 가져왔습니다.

핵심 표적 유전자 스크리닝
MCODE 플러그인을 사용한 모듈 분석은 MCODE 점수가 54.19029³¹점인 가장 높은 점수를 받은 클러스터 모듈을 식별했습니다. 클러스터 허브 모듈 내에서 QZF의 항우울 효과에 중요한 64개의 주요 표적을 식별했습니다(그림 4C). CytoNCA 플러그인을 사용하여 세 가지 중심성 메트릭인 DC(Degree Centrality), CC(Closeness Centrality) 및 BC(Betweenness Centrality)를 기반으로 고도로 연결된 노드를 스크리닝했습니다. 특히, 차수 중심성은 노드가 네트워크 내에서 가지고 있는 직접 연결의 수를 측정합니다. 근접성 중심성은 노드와 다른 모든 노드 사이의 평균 최단 경로 길이의 역수를 정량화하여 노드가 다른 노드에 얼마나 효율적으로 액세스할 수 있는지를 나타냅니다. 매개성 중심성(Betweenness centrality)은 노드가 모든 노드 쌍 사이의 최단 경로에 나타나는 빈도를 평가하여 중재 역할을 반영합니다. 이러한 메트릭을 기반으로 코어 네트워크를 구성하고 가장 많이 연결된 노드 상위 10개(BCL2, AKT1, IL6, BCL2L1, MTOR, CASP3, TP53, STAT3, NFKB1 및 HIF1A)를 식별했습니다(그림 4D). 데이터 필터링에 이어 이 10가지 주요 표적 유전자에 대한 기능적 농축 분석을 수행하여 생물학적 기능을 추가로 밝혔습니다.

GO 농축 분석
GO 농축 분석은 총 2,783개의 주석이 달린 항목을 산출했으며 2,385개는 통계적 유의성을 보였습니다. 이 분석은 생물학적 과정(BP), 분자 기능(MF) 및 세포 구성 요소(CC) 범주에 주로 영향을 미쳤습니다. 구체적으로 GO-BP 범주에는 2,450개의 항목이 포함되었으며 그 중 1,926개가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 분자 기능(GO-MF) 범주는 184개 항목을 식별했으며 117개는 통계적 유의성을 보였습니다. 세포 구성 요소(GO-CC) 범주에서는 149개 항목이 발견되었으며, 이 중 59개가 통계적으로 유의했습니다(그림 5).

KEGG 농축 분석
KEGG 경로 농축 분석은 10개의 주요 목표와 관련된 총 156개의 경로를 식별했으며, 이 중 119개는 통계적 유의성을 보여주었습니다. 이 그림은 농축 점수가 가장 높은 상위 20개 경로를 보여줍니다(그림 6). 일부 관련 질병이 제거됨에 따라 HIF-1과 JAK-STAT 신호 경로라는 두 가지 신호 경로가 남았으며, 이는 QZF와 우울증의 주요 경로로 예측되었습니다.

QZF 및 우울증에 대한 주요 표적 경로 네트워크
QZF와 QZF가 우울증에 미치는 영향 사이의 기계론적 관계를 밝히기 위해 우리는 중추적인 TCM-화합물-표적-경로 상호 작용 네트워크를 개발했습니다(그림 7). 네트워크 분석 소프트웨어를 활용하여 가장 유의미한 p-값과 관련 표적을 가진 신호 전달 경로를 시각화했습니다. 결과 네트워크 그래프는 93개의 노드와 218개의 에지로 구성되었습니다. 또한 주요 유전자와 해당 활성 화합물을 나타내기 위해 Sankey 다이어그램을 생성했으며, 특히 HIF-1 및 JAK-STAT 핵심 신호 경로에 초점을 맞췄습니다(그림 8).

분자 도킹
화합물의 표적 특이성을 입증하기 위해 분자 도킹 분석이 채택되었습니다. 이 기술은 리간드와 단백질 표적 사이의 결합 친화도를 평가하며, 여기서 결합 에너지의 크기가 낮을수록 결합 부위에 대한 리간드의 더 강한 상호 작용과 더 가까운 근접성을 나타냅니다³³. 그 결과, 결합 에너지는 HIF1A 및 Glycyrrhiza flavonol A의 경우 -8.7 kcal/mol, STAT3 및 Ginsenoside rh2의 경우 -8.5 kcal/mol, BCL2 및 Isolicoflavonol의 경우 -7.6 Kcal/mol, MTOR 및 Licochalcone B의 경우 -6.8 Kcal/mol, AKT1 및 Kaempferol의 경우 -6.7 Kcal/mol, IL6 및 Linolenic acid의 경우 -5.2 Kcal/mol인 것으로 나타났습니다.

전반적으로, 분자 도킹 결과는 화합물이 표적에 대해 강한 결합 친화성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 각 단백질의 결합 에너지는 다음과 같이 시각화됩니다 : 흰색 만화 패턴은 단백질 수용체를 나타내고, 파란색은 소분자 리간드를 나타내고, 노란색 점선은 리간드와 수용체 사이에 형성된 수소 결합을 나타내고, 녹색은 단백질 수용체와 소분자 리간드 사이의 수소 결합의 부착 부위를 나타냅니다. 그리고 숫자는 수소 결합 거리를 의미하며, 이는 리간드와 수용체 사이의 결합이 매우 안정적임을 의미합니다(그림 9)³⁴.

그림 1: 실험용 쥐에 대한 그룹화 및 행동 테스트의 순서도. 약어: CRS = chronic restraint stress; QZF (Q) = 치앙지팡; F = 플루옥세틴; OFT = 오픈 필드 테스트; FST = 강제 수영 테스트; SPT = 자당 선호도 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: CRS에 의한 쥐 우울증 모델에 대한 QZF의 효과. (A) 0일차와 28일차의 자당 섭취 수준(%). (B) 0일차와 28일차의 체중(g). (C) 4주차 오픈 필드 테스트에서 쥐의 궤적 플롯. (D) 0일과 28일의 오픈 필드 총 거리. (E) 4주차에 각 그룹에서 OFT의 중앙 지역에 머무른 기간. ** P < 0.01은 CRS 그룹과 비교하여 F 및 QZF 그룹 간에 상당한 차이를 나타냅니다. (F) 4주차에 각 그룹의 FST 부동성 시간(%). * P < 0.01은 CRS 그룹과 비교하여 F 그룹 간에 상당한 차이를 나타냅니다. P < 0.001은 QZF 그룹이 CRS 그룹에 비해 유의한 차이를 보였음을 나타냅니다. 약어: CRS = chronic restraint stress; QZF = 치앙지팡. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: QZF-Compound-Target 네트워크. 녹색 삼각형은 QZF의 전통 한의학을 나타냅니다. 원은 전통 중국 의학의 구성 요소를 나타냅니다. 마름모꼴은 목표를 나타냅니다. 분홍색 화살표는 여러 한약의 공통 성분을 나타냅니다. A (MOL000211)는 Bai shao 및 Zhi gan cao와 관련이 있습니다. B (MOL000358)는 Bai shao, Chuan bei mu, Gu zhi 및 Ren shen과 관련이 있습니다. C(MOL000359)는 Bai shao, Chuan bei mu 및 Gui zhi와 연결됩니다. D (MOL000422)는 Bai shao, Zhi gan cao 및 Ren shen에 해당합니다. E(MOL000492)는 Bai shao 및 Gu zhi와 관련이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 교차 표적 식별 및 핵심 표적 스크리닝. (A) QZF와 우울증의 공통 표적에 대한 벤 다이어그램. 연한 녹색 원은 QZF의 활성 성분의 표적 단백질을 나타냅니다. 파란색 원은 우울증과 관련된 단백질을 나타냅니다. 두 색상이 교차하는 겹치는 영역은 총 612개에 달하는 공유 단백질을 보여줍니다. (B) QZF와 우울증의 PPI 네트워크. (C) MCODE 분석. (D) 상위 10개 핵심 목표. 약어: QZF = qiangzhifang; PPI = 단백질-단백질 상호 작용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 공통 대상의 GO 농축 분석을 위한 히스토그램. 녹색 막대는 생물학적 과정을 나타냅니다. 빨간색 막대는 분자 기능을 나타냅니다. 파란색 막대는 세포 구성 요소를 나타냅니다. 각 막대의 높이는 해당 GO 항과 관련된 유전자 수를 반영합니다. 약어 : GO = Gene Ontology. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 우울증에 대한 QZF의 치료 표적에 대한 KEGG 농축 경로. (A) 상위 20개 경로의 막대 차트, P-값별로 순위가 매겨져 있습니다. (B) 상위 20개 경로의 버블 차트: 포인트 크기는 유전자 번호를 나타냅니다. 색상 강도는 P-값의 유의성을 반영합니다. (C) KEGG 경로의 기능적 주석. 약어 : KEGG = 유전자 및 게놈의 교토 백과 사전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: TCM-화합물-표적 경로의 상호 작용 네트워크. 빨간색은 QZF와 우울증을 나타내고, 보라색은 신호 경로를 나타내고, 녹색은 핵심 경로 단백질을 강조하고, 노란색은 QZF 내의 전통 한의학을 나타내고, 파란색은 구성 허브 화합물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: HIF-1 및 JAK-STAT 신호 전달 경로를 기반으로 한 QZF의 항우울 효과에 대한 TCM-화합물-표적 경로의 Sankey 다이어그램. 약어: QZF = qiangzhifang; TCM = 중국 전통 의학; HIF-1 = 저산소증 유발 인자-1; JAK-STAT = Janus-activated kinase-signal tranducers and activators of transcription(전사의 야누스 활성화 키나아제 신호 전달인자). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 분자 도킹 검증 결과. (A) QZF의 대표 성분과 대상 단백질 분자 사이의 결합 에너지(kcal/mol)의 히트 맵 (B) 도킹 상황의 시각화. 약어 : QZF = qiangzhifang. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1 : QZF 전통 한약 과립의 제조. 약어 : QZF = qiangzhifang. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

CRS는 우울증의 동물 모델을 확립하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 이 모델은 인간의 삶에서 발생하는 만성적인 심리적 스트레스를 모방하고 쥐에서 우울증과 유사한 행동을 유도합니다³⁵. 이 연구에서 쥐 구속 튜브는 투명 플라스틱으로 제작되어 동물의 안전을 보장하는 동시에 실험 중에 명확한 관찰이 가능했습니다. 길이가 약 18cm, 직경이 6cm인 투명 튜브는 각각 직경이 1cm인 여러 개의 환기구가 있으며 쥐에게 충분한 공기 흐름을 제공하기 위해 측면과 뚜껑을 따라 균일하게 분포되어 있습니다. 스트레스를 받은 쥐는 우울증의 특징인 행동 변화와 함께 무기력증과 눈이 흐릿한 것과 같은 우울 증상을 보였다. 구체적으로, 이러한 변화에는 OFT의 운동 활동 감소, FST의 부동성 시간 연장, SPT의 자당 소비 감소가 포함되었습니다. 이러한 행동 징후는 임상적 우울증 환자에서 관찰되는 서동증, 무쾌감증 및 흥미 상실과 매우 유사합니다.

우울증의 복잡한 병리학적 메커니즘을 연구하는 맥락에서, 네트워크 약리학과 분자 도킹 기술의 결합은 우울증 치료에서 전통 한의학 화합물의 분자 메커니즘을 분석하기 위한 혁신적인 전략을 제공합니다. 본 연구는 HIF1A, STAT3, BCL2, MTOR, AKT1, IL6를 우울증 치료에서 QZF의 핵심 표적으로 확인하였다. 이러한 표적은 주로 HIF-1 및 JAK-STAT 신호 경로에서 강화되었습니다. 이 두 가지 신호 전달 경로는 신경 염증, 산화 스트레스 및 세포사멸과 같은 우울증의 주요 병리학적 과정에서 중심적인 역할을 합니다.

세포 산소 대사의 중심 조절 기전 역할을 하는 HIF-1 신호전달 경로는 신경 보호, 항산화 스트레스 반응, 혈관 신생 등 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다³⁶. 연구에 따르면 우울증을 앓고 있는 사람의 뇌 조직은 뚜렷한 저산소성 미세환경 및 산화적 스트레스 손상을 보이며, 이는 신경염증 반응의 활성화 및 신경전달물질의 불균형과 밀접한 관련이 있다³⁷. Semenza의 연구는 저산소 조건에서 HIF-1α가 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 에리트로포이에틴(EPO) 및 미토콘드리아 유전자를 포함하여 산소 대사 및 항산화 방어 메커니즘과 관련된 유전자를 상향 조절한다는 것을 보여줍니다. 결과적으로, 이는 미토콘드리아 기능을 향상시키고, 뇌 미세혈관의 형성을 촉진하며, 뇌 조직으로의 산소 전달을 증가시키고, 활성산소종(ROS) 축적을 감소시킨다³⁸.

추가 실험 연구에서는 HIF-1α 결핍이 산화 스트레스에 대한 신경 세포의 민감성을 현저히 향상시켜 세포사멸 신호 경로의 비정상적인 활성화를 유발하는 것으로 나타났습니다³⁹. 이것은 신경 세포 사멸과 진행성 인지 기능 저하의 현저한 증가로 이어집니다. 대조적으로, 형질전환 마우스 모델에서 뉴런 특이적 HIF-1α 과발현은 뉴런 생존율과 시냅스 밀도를 모두 크게 향상시킵니다⁴⁰. 이러한 발견은 항산화 방어 기전에서 HIF-1α의 중요한 역할을 입증할 뿐만 아니라 신경 가소성 리모델링 및 시냅스 구조 최적화를 촉진하여 뇌 기능을 향상시키는 데 있어 HIF-1α의 잠재적인 치료적 중요성을 강조합니다. 또한, HIF-1 신호전달 경로는 NF-κB 신호 전달 경로를 길항하여 염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 생성을 감소시키고, 신경염증을 억제하며, 잠재적인 신경 보호 및 항우울 효과를 나타냅니다⁴¹.

특히 QZF의 활성 성분 중 하나인 Glycyrrhiza flavonol A는 항산화 및 항염 특성을 나타내는 것으로 확인되었습니다. 이 연구에서 분자 도킹 데이터는 liquiritigenin A가 -8.7kcal/mol에 달하는 HIF-1α 단백질에 대한 높은 결합 친화력을 나타낸다는 것을 밝혔습니다. 이 발견은 Glycyrrhiza flavonol A가 HIF-1α를 직접 표적으로 하여 단백질 안정성 또는 전사 활성을 조절할 수 있음을 강력하게 나타냅니다. 결과적으로, HIF-1 신호 경로 내에서 산소 대사 및 항산화 방어에 관여하는 유전자의 발현을 조절하여 저산소 조건에서 신경 세포의 생존을 향상시키고 우울증과 관련된 신경 손상을 완화합니다.

JAK-STAT 신호전달 경로는 사이토카인 신호 전달의 중심 허브 역할을 하며 염증 조절, 면역 반응 조절 및 신경 세포 생존을 포함한 다양한 생물학적 과정에서 중추적인 역할을 합니다^42,43. 광범위한 연구에 따르면 우울증의 발병 기전은 JAK-STAT 신호 전달 경로의 조절 장애와 복잡하게 연결되어 있습니다⁴⁴. Dowlati(다울라티) 등이 수행한 메타 분석에 따르면, 건강한 대조군과 비교했을 때, 우울증 환자에서 IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 혈청 수치가 유의하게 증가했으며, 이는 우울 증상의 중증도와 긍정적인 상관관계가 있었다⁴⁵. 구체적으로 말하자면, 이러한 전염증 인자는 JAK-STAT 경로를 활성화하여 염증 반응을 유도할 수 있습니다. 이 과정은 뉴런과 신경교세포에 직접적인 손상을 유발할 뿐만 아니라 시냅스 구조와 기능을 손상시켜 궁극적으로 환자의 인지 및 정서적 장애를 악화시킨다⁴⁶.

또한, JAK-STAT 경로의 과도한 활성화는 신경 세포 사멸과 밀접한 관련이 있습니다. 지속적인 STAT3 인산화는 Caspase 계열의 구성원을 포함한 pro-apoptotic 유전자의 발현을 상향 조절하여 궁극적으로 신경 세포 손실을 초래합니다. 또한, 이 경로의 비정상적인 활성화는 해마 영역의 신경 발생을 손상시키고 시냅스 가소성을 감소시켜 신경 기능 결손을 악화시킨다⁴⁷. 이 연구에서 QZF의 중요한 활성 성분인 진세노사이드 Rh2는 분자 도킹 분석에서 STAT3 단백질과 상당한 결합 친화성을 나타냈습니다. 이러한 연구 결과에 바탕을 둔 진세노사이드 Rh2는 STAT3 활성화를 특이적으로 억제하여 전염증성 사이토카인의 생성 및 방출을 감소시킴으로써 신경염증 반응을 효과적으로 완화할 수 있다⁴⁸.

두 가지 핵심 신호 경로인 HIF-1 및 JAK-STAT 외에도 이 연구는 QZF의 항우울 작용 동안 다른 활성 성분과 표적 간의 시너지 상호 작용을 확인했습니다. 표준 항세포사멸 단백질인 BCL2는 세포의 생존을 유지하고 세포사멸 신호전달 경로를 억제하는 데 필수적인 역할을 합니다⁴⁹. QZF에서 이솔리코플라보놀은 BCL2 단백질을 특이적으로 표적으로 삼고 활성화함으로써 항산화 및 항세포사멸 특성을 나타내어 신경 세포 사멸을 효과적으로 억제하고 뉴런을 보호하며 우울증과 관련된 신경 병리학적 변화를 개선합니다. 또한, 우울증 환자의 비정상적인 MTOR 신호전달 경로는 신경 기능 장애와 밀접한 관련이 있다⁵⁰. 연구에 따르면 리코칼콘 B는 MTOR 신호 전달 경로⁵¹을 조절하여 신경 세포의 성장과 생존을 촉진하고 시냅스 가소성 및 기능적 연결성을 향상시켜 항우울 효과를 발휘합니다. 또한, 강력한 항산화 및 항염증 활성을 특징으로 하는 천연 플라보노이드 캠페롤(kaempferol)은 AKT1 신호 경로를 특이적으로 활성화합니다. 여러 주요 다운스트림 분자의 조절을 통해 신경 세포의 생존을 촉진할 뿐만 아니라 기능 회복을 가속화하여 QZF의 항우울 효과에 대한 추가 분자 표적 지원을 제공합니다.

요약하면, 본 연구는 네트워크 약리학과 분자 도킹을 활용하여 우울증 치료에 있어 QZF의 치료 경로, 핵심 표적 및 효과적인 활성 성분을 예측했습니다. QZF의 항우울 효과는 HIF-1 및 JAK-STAT 를 포함한 여러 신호 경로를 조절하고 신경 염증, 산화 스트레스 및 세포사멸과 같은 주요 병리학적 과정을 표적으로 하여 항우울 효과를 발휘할 수 있음을 시사하는 우울증의 쥐 모델에서 검증되었습니다. 이 발견은 우울증의 기저에 있는 병리학적 메커니즘에 대한 이해를 심화시킬 뿐만 아니라 우울증 치료에 전통 한의학 공식을 적용하기 위한 이론적 토대와 새로운 치료 목표를 제공합니다. 그러나 이 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. QZF에서 여러 성분의 시너지 메커니즘은 완전히 규명되어야 하며, 생체 내에서 이러한 성분의 대사 과정 및 상호 작용은 추가 조사가 필요합니다. 향후 연구에서는 액체 크로마토그래피, 고처리량 염기서열분석 및 다중 오믹스 통합과 같은 첨단 기술과 함께 체외 및 생체 내 실험을 통합하여 QZF의 항우울 효과와 관련된 주요 표적 및 경로를 포괄적이고 정확하게 식별함으로써 네트워크 약리학을 통해 이루어진 예측을 검증하고 확장할 수 있습니다.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 중국 국립자연과학재단(82374311), 국가전통중의약관리국 고급 한의학(TCM) 기초 이론 핵심 분야 건설 프로젝트(zyyzdxk-2023118), 국가 전통 중의학 전문가 스튜디오 건설 프로젝트(National Chinese Medicine Education Letter No.75) 및 산둥성 자연과학재단(ZR2022LZY016)의 지원을 받았다. QZF 과립은 산동 전통 중국 의학 대학 부속 병원 의약품 부서에서 제조했습니다.