ネットワーク薬理学と慢性拘束ストレス誘発性うつ病ラットモデルにおけるQiangzhifangの抗うつ薬序の検証

本研究では、慢性拘束ストレス誘発性うつ病のラットモデルにおいて、Qiangzhifangの抗うつ薬の有効性を評価し、ネットワーク薬理学と分子ドッキング解析により、HIF-1およびJAK-STAT経路に対するその調節効果を解明しました。

うつ病は、治療に重大な課題をもたらす複雑な精神疾患です。伝統的な中国医学で使用される化合物であるQiangzhifang(QZF)は、うつ病の治療における潜在的な臨床効果を示しています。しかし、QZFの作用機序や有効成分は十分に解明されていません。この研究の主な目的は、ネットワーク薬理学の予測と実験的検証を統合することにより、うつ病の緩和のためのQZFの効果的な有効成分と潜在的な分子メカニズムを解明することでした。

本研究では、慢性拘束ストレス(CRS)ラットモデルを採用し、オープンフィールド試験(OFT)、ショ糖選好試験(SPT)、強制水泳試験(FST)などの行動試験を実施し、QZFのうつ病に対する治療効果を評価しました。行動パラメータに関しては、QZF群はモデル群と比較して有意に高い体重、ショ糖選好比、および中心ゾーン滞留時間を示し(P < 0.01、 P < 0.01、 P < 0.01)、強制遊泳試験では動けない時間が有意に短縮されました(P < 0.001)。ネットワーク薬理学および分子ドッキング研究は、QZFがHIF-1およびJAK-STAT経路を調節することにより抗うつ効果を有する可能性があることを示唆しており、AKT1、IL-6、MTOR、TP53などの主要な標的遺伝子が炎症、神経保護、およびアポトーシスに関与しています。結論として、この研究は、うつ病の包括的な治療のための漢方薬化合物の近代化と開発に関する新たな洞察を提供します。

うつ病は、世界的に蔓延している健康上の課題であり、持続的な気分の落ち込み、興味と喜びの低下、認知障害と神経障害を特徴としています¹。世界保健機関(WHO)の報告によると、うつ病は世界中で約3億8000万人に影響を及ぼしており、この数字は増加すると予想されています²。うつ病は、複雑で多因子性の精神障害であり、患者の生活の質に影響を及ぼし、高い発生率、再発率、障害率を特徴とする社会にかなりの経済的および医学的負担をもたらします³。

うつ病の病因は複雑で、正確なメカニズムはまだ完全には理解されていません。この分野の研究が進むにつれ、神経炎症、酸化ストレス、アポトーシスなどの要因が注目されています。研究によると、うつ病の患者は健康な人と比較してTNFやインターロイキン-1βなどの炎症誘発性サイトカインのレベルが高く、炎症状態の患者ではうつ病の有病率が高いことが観察されています⁴。酸化ストレスでは、有害な刺激に反応して活性酸素種(ROS)が過剰に生成され、体の抗酸化防御を圧倒し、酸化システムと抗酸化システムのバランスが崩れ、組織に損傷を与えます。うつ病における酸化ストレスの上昇は、脂質の過酸化を促進し、細胞の遺伝子やタンパク質への損傷を悪化させ、ニューロンの機能に影響を与え、ニューロンの変性、アポトーシス、および可塑性の障害に寄与する可能性があります⁵。さらに、うつ病患者の臨床症状、生化学的マーカー、および脳構造で観察される変化は、アポトーシスに関連しています。画像検査では、うつ病患者の海馬容積の減少と萎縮が明らかになり、ニューロンのアポトーシスがこれらの変化に重要な役割を果たす可能性があります⁶。

現在、薬物治療はうつ病を管理するための主要なアプローチであり、選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)とノルエピネフリン再取り込み阻害薬(NRI)が臨床診療で頻繁に採用されています⁷。しかし、これらの薬には重大な副作用が伴います。頭痛や不眠症などの中枢神経系の症状に加えて、ほとんどの抗うつ薬は、吐き気や下痢などの胃腸の副作用もよく示します^8,9。一部の抗うつ薬はまた、性機能障害を引き起こすことがあり¹⁰、これは治療結果に深刻な影響を及ぼし、うつ病患者の服薬アドヒアランスを低下させます¹¹。さらに、これらの薬の有効性は一部の患者にとって限られています。最近のメタボロミクス研究は、腸内細菌叢の個人差が薬効に影響を与える可能性があることを示しています¹²。したがって、より安全で効果的な治療法の開発は、うつ病研究において依然として重要な焦点です。

伝統的な漢方薬(TCM)製剤は、複数の成分、標的、および経路を含む相乗効果に起因するうつ病の治療において大きな可能性を示しています¹³。TCMは、活発な陽気が体の活力を維持するために不可欠であると仮定しています。したがって、Yuanqing Ding教授は、TCMの診断と治療の独自の原則と広範な臨床経験を活用して、「yang yu shen tui」がうつ病の基本的な病因であると提案しました。この概念に基づいて、彼はこの病因に特異的に対処するためにQiangzhifang(QZF)を開発しました¹⁴。うつ病の治療におけるQZFの臨床応用は、有意な有効性を示しており、総有効率は71.43%¹⁵です。QZFは、 Ramulus cinnamomi (gui zhi、GZ)、 Polygala tenuifolia (yuan zhi、YZ)、 Alpinia oxyphylla miq (yi zhi ren、YZR)、 Paeonia lactiflora (bai shao、BS)、 Fritillariae cirrhosae bulbus (chuan bei mu、CBM)、 オタネニンジン (ren shen、RS)、 Rhodiola rosea L (hong jing tian、HJT)、 甘草 (gan cao、GC)(補足ファイル1)など、さまざまな伝統的な中国の薬用材料で構成されています。).研究によると、 Polygala tenuifolia はサポニンが豊富で、神経保護効果を示す^{ことが示されています16}。同様に、 Ramulus Cinnamomi-Paeonia lactiflora ハーブペアは、痛みやうつ病の緩和に潜在的な有効性を示しています¹⁷。さらに、高麗人参の総サポニンは、ラットの海馬炎症性サイトカインレベルを低下させ、抑うつ行動を改善し、海馬神経損傷を弱めることができます¹⁸。甘草には主にトリテルペノイドとフラボノイドが含まれています。甘草の総フラボノイド(LF)は、抑うつ行動を改善し、BDNF / TrkBシグナル伝達経路を調節し、シナプス可塑性を高めることにより、抗うつ薬の役割を果たすことができます¹⁹。しかし、QZFの抗うつ効果の根底にある特定のメカニズムは不明のままであり、したがって、その広範な適用は限られています。

そこで、本研究では、CRS抑制ラットモデルを確立し、行動実験を通じてラットのうつ病に対するQZFの治療効果を実証し、ネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を用いてQZFの抗うつメカニズムを系統的に評価することを目指している²⁰。QZFの有効成分と潜在的な標的を明らかにすることで、うつ病の核となる標的を正確に特定することができます。QZFの作用機序を深く探求することで、うつ病患者により安全で効果的な治療選択肢を提供できるだけでなく、うつ病の治療におけるTCMの適用に科学的根拠を提供できると信じています。

すべての実験プロトコルは、山東中医薬大学の動物実験倫理委員会(承認番号:YYLW2023000327)によって承認され、国立衛生研究所が発行した実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠していました。この実験では、平均体重が(140 ± 10)gのSPFグレードの健康な雄Wistarラット40匹を使用しました(図1)。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアのリストについては、 資料の表 を参照してください。

1.ラットうつ病モデル

1. 動物の飼育とグループ化
   1. 動物と一緒に飼育室に入り、テールマーキング器具を使って番号を付けます。
   2. ラットをケージに個別に収容し、21±2°Cの温度と12時間/12時間の明暗サイクルを維持します。
   3. ラットを実験室で7日間順応させ、餌と水 を自由に利用できるように しながら、適応のために毎日ネズミを扱います。
   4. 順応期間終了後、体重を測定し、ショ糖選好試験(SPT)とオープンフィールド試験(OFT)を実施します。
   5. 実験データに基づいて、ラットを4つのグループに分け、各グループが10匹のラットで構成されるようにします:コントロール(CON)グループ、モデル(CRS)グループ、QZFグループ、およびフルオキセチン(F)グループ)。
2. 慢性拘束ストレス(CRS)ラットモデルの確立
   1. ラット拘束装置を構築します。ラットのサイズ²¹に適した直径と長さの透明なプラスチックチューブを選択し、ラットが逃げないようにしながら立って内側に向きを変えることができます。電気はんだごて穴あけ器を使用して、プラスチックチューブの側面と蓋に穴を開け、適切な空気循環を確保します。
   2. 薬物の毎日の胃内投与の1時間後にラットを拘束装置(グループCのものを除く)にそっと置き、ラットが快適な位置にあることを確認します。.
   3. 拘束期間中は、すべての群れのネズミから餌と水を奪う。拘束期間終了後は、十分な餌と水を均一に与えてください。毎日の拘束時間を6時間(9時30分から15時30分まで)に固定し、連続して28日間維持します。

2.薬物介入

1. 強制経口投与:1mLの溶液/体重100g、フルオキセチン(2.7mg・^kg-1・^day-1)およびQZF(2g・^kg-1・^day-1)²²。グループ C と CRS に、単一変数制御用の同等の生理食塩水を提供します。
   注:毎日の薬物投与は08:00に実施され、モデル確立と同期して開始され、28日間のモデリング期間を通じて持続しました。

3.ショ糖選好試験(SPT)

1. 実験が始まる24時間前に、ラットから餌と水を奪います。
2. 1%ショ糖水溶液を調製し、その溶液と純水を実験動物の飲用ボトルに充填して秤量します。純水とショ糖水の消費量を、実験前後のボトルの重量を量ることにより測定します。
3. 各ラットケージカバーの取水口にショ糖溶液1本と純水1本を左と右に置きます。ラットが水分摂取のために片側を好むのを防ぐために、実験の30分後に左右の水筒の位置を入れ替えます。
4. 実験の1時間後、すべての水筒を取り外し、すぐに計量し、ショ糖溶液と純水の消費量を記録します。次の式を使用して、毎週のショ糖選好比を計算します。
   ショ糖の好みの値 = × 100%

4. 体重測定

1. ラットが実験室に入ると、毎週ラットの体重を量り、体重を量る決まった時間を午前7:00に設定します。このスケジュールは、体重の変化を観察しやすくするために確立します。

5. オープンフィールド試験(OFT)

1. 実験を開始する前に、ラットを行動室に1時間順応させ、オープンフィールドボックスの照明を調整して、均等に分布するようにします。追跡ソフトウェアでネズミがはっきりと見えることを確認します。
2. ビデオ追跡および分析システムを利用して、オープンフィールドボックス(50 cm x 50 cm x 50 cm)の底面を9つの等面積の正方形グリッドに分割します。壁に隣接する 8 つの通芯を周辺領域として指定し、中央通芯を中央領域として指定します。
3. ラットをオープンフィールドボックスの中央領域に置きます。ビデオトラッキングシステムを使用して、ラットの動きを5分間記録します。
4. 各ラットをテストした後、75%エタノールでチャンバーを洗浄して残留臭気を除去し、次のラットの行動に干渉しないようにします。オープンフィールドアクティビティの合計距離 (mm) と、OFT レコードの中央グリッドのエントリ数を入力します。

6.強制水泳テスト(FST)

注:ラット強制水泳実験は、事前実験と形式実験で構成されています。正式な実験の24時間前に、同じ手順に従って、ラットが15分間泳いで事前実験を行います。

1. 実験動物を実験の少なくとも30分前に行動室に運び、環境に順応できるようにします。
2. 透明な円筒形のプレキシガラス製ウォーターシリンダー(高さ50cm、直径20cm)を用意し、23〜25°Cの水で満たします。 動物の体重に基づいて水深を調整し、動物の尾がシリンダーの底から一定の距離を保つようにします。
3. ラットをゆっくりと水筒に入れ、実験中は静かにしてください。カメラと信号収集システムをアクティブにします。300秒以内に浮遊不動の持続時間を観察し、記録します。実験の最後には、すぐにラットを水から取り出し、乾燥させます。
4. 各セッションの後、次のラットへの影響を防ぐために水を交換してください。

7. ネットワーク薬理学的予測

1. QZF化合物と推定ターゲットのコレクション
   1. Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)データベース(https://old.tcmsp-e.com/)²³、HERBデータベース²⁴、およびTCMIDデータベース(https://www.bidd.group/TCMID/)にアクセスします。QZFのGZ、YZ、YZR、BS、CBM、RS、HJT、ZGCの8つのTCM名をキーワードとして、ハーブの活性化合物やターゲットを検索します。TCMSP と Swiss のターゲット予測 (http://www.swisstargetprediction.ch/) からターゲットを収集します。フィルター値を Probability* > 0 に設定します。
      注:通常、成分は、薬物動態学的特性に基づいて有効成分として含まれていました:経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%および薬物様特性(DL)≥0.18²⁵。
2. 疾患ターゲットの予測
   1. GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)でキーワード「うつ病」を検索し、うつ病に関連する遺伝子標的を取得し、疾患標的の電子スプレッドシートをダウンロードし、平均値よりも高い遺伝子スコアをフィルタリングし、うつ病ターゲット²⁶のリストをコンパイルする。
3. 薬物-成分-疾患-標的ネットワーク
   1. 新しいスプレッドシートを作成し、うつ病関連のターゲットと薬物ターゲットを同じ列に入力します。メニューバーの [スタート ]をクリックします |条件付き書式 |セルの強調表示ルール |重複する値。表示されるダイアログボックスで形式(たとえば、「ライトレッドフィル」)を選択します²⁷、 クリック OK 結果を表示します。
   2. ネットワーク分析ソフトウェアを起動し、メニューバーの[ファイル]をクリックしてスプレッドシートファイルをインポートします|インポート |ネットワーク。左側のコントロールパネルにあるスタイルパネルでノードのサイズと色を調整することにより、ネットワークの外観を最適化します。ネットワークトポロジ解析を実行するには、メニューバーの[ツール]をクリックします。 |ネットワークの解析²⁷.
4. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク
   1. Jvenn(https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html)ツールにアクセスし、化合物ターゲットと疾患ターゲットを別々にアップロードし、化合物推定ターゲットと疾患ターゲット間の重複遺伝子(OGE)をプロットします。画像内の数値をクリックしてスプレッドシートにコピーし、ベン図の画像をダウンロードします。
   2. STRING データベース (https://stringdb.org/)²⁸ にアクセスし、スプレッドシートの OGE をデータベースに入力します。具体的には、QZF 抗うつ病のオーバーラップ ターゲット リストを [名前のリスト] ダイアログ ボックスに貼り付けます。「生物」セクションで「ホモ・サピエンス」を選択し、「検索」をクリックします。続ける。タイトルバーから[エクスポート]オプションを選択し、PNG形式とTSV形式の両方でPPIネットワークの概要テーブルをダウンロードします²⁹。
5. コアタンパク質のスクリーニング
   1. ネットワーク解析ソフトウェア(https://cytoscape.org/)を起動します。次に、メニューバーで、[ファイル] |インポート |ネットワーク |[ファイル ]は、前の手順³⁰で生成したTSV形式のファイルをインポートする。
   2. メニューバーで 「ネットワークの解析 」を選択し、「 解析 」ボタンをクリックします。次に、解析結果を表示し、ノード数、エッジ数、平均次数など、ネットワークの全体的な構造特性を理解します。
   3. [アプリ] |メニューバーのアプリマネージャー。MCODE を検索し、プラグインをインストールし、プラグインを実行してハブ ターゲットを取得します。次に、CytoNCAを検索し、プラグインをインストールして、Degree、Closeness centrality (CC)、Betweenness centriity (BC)の3つのパラメータ値に注目します。これらのパラメータの値に従って、一般的にコアタンパク質³¹と考えられているDegree、CC、およびBCが高いノードをスクリーニングする。
6. Gene ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)のエンリッチメント解析
   1. バイオインフォマティクスプラットフォーム(https://www.omicshare.com/)を開きます。[ツール ]メニューをクリックし、ID 遺伝子変換ツールを見つけてクリックします。次に、 アップロードファイル ボタンをクリックし、ターゲット遺伝子のコアで生成されたステップを選択し、変換されたファイルIDリストをダウンロードします。
   2. [ツール] メニューで、[Dynamic KEGG enrichment Analysis] ツールをクリックします。遺伝子IDリストをアップロードします。「Species」オプションで、「Homo sapiens」を選択し、「Submit」ボタンをクリックします。
   3. [ツール] メニューで、[動的 GO エンリッチメント分析] ツール |遺伝子オプション |ファイルのアップロードオプション。遺伝子IDリストを選択し、SpeciesオプションでHomo sapiensを選択します。解析用の GO タイプ(生物学的プロセス、分子機能、細胞成分など)を選択します。
   4. KEGGおよびGOエンリッチメント解析の結果について、 フィルタリングしきい値 を p < 0.05に設定します。カウントを降順に並べます。

8. 分子ドッキング検証

1. PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) の Web サイトにアクセスしてください。検索バーにターゲット化合物を入力します。2Dストラクチャーをクリックしてダウンロードします。
2. PDB (https://www.Rcsb.org/) データベースを開きます。高分解能で、元の配位子を含む結晶構造を選択します。PDB ファイルをダウンロードします。
3. タンパク質構造を最適化するには、分子可視化ソフトウェアを開きます。ダウンロードしたPDBファイルを読み込みます。水分子を除去し、最適化されたPDBファイルを保存します。
4. 分子ドッキングソフトウェアを開き、最適化されたPDBファイルをインポートします。 AutoDockToolsで、[ 編集]をクリックします|水 分子を削除するには、水を削除します。 [編集] |水素の添加 | タンパク質とリガンドに水素原子を追加するために加える²⁹。
5. AutoDockTools で、レセプタ バーを receptor.pdbqt に、リガンド バーを ligand.pdbqt に設定します。pdbqt を開きます。ファイルしてタンパク質とリガンドの結合部位を表示し、ドッキングボックスのサイズと位置を設定して、受容体タンパク質とリガンド化合物を完全に囲むことができるようにします。AutoDockToolsで、[グリッド]をクリックします|[グリッド ボックスを定義]では、ボックスの中心座標と寸法を設定し、分子ドッキングにデフォルト値を使用します。ドッキングフレームは、結合エネルギーの降順で自動的にソートされます。
6. 結果ファイルを開き、最適な結合エネルギー値を記録します。結合エネルギーが低いほど、結合が安定していることを示します。分子可視化ソフトウェアを使用して、結果ファイルを読み込みます。リガンドと受容体の相互作用がはっきりと表示されるように、表示と色を調整します。

9. 統計分析

1. 科学データ分析および視覚化ソフトウェアで統計分析を実施し、すべてのデータをSEM±平均として表します。2つ以上のグループ間の比較に一元配置分散分析を使用します。
2. 0.05 < P の値を統計的に有意であるとします。

CRS誘発ラットうつ病モデルにおける行動試験結果

ショ糖選好試験結果
ベースラインでは、群間でショ糖選好係数に差はありませんでした(P > 0.05)。28日間の介入後、CRS群のショ糖選好係数はCON群よりも有意に低かった(P < 0.05)一方で、F群とQZF群はCRS群と比較して有意に高い係数を示した(ともに P < 0.01)。その結果、ストレスを受けたラットは典型的な無快感症状を示し、FおよびQZFによる治療によって緩和されたことが示されました(図2A)。

体重の結果
CRS導入前は、群間で有意差は認められませんでした(P > 0.05)。4週間のストレス後、CRS群の体重増加率はCON群よりも有意に低かった(P < 0.01)一方で、F群とQZF群はM群よりも有意に高い成長率を示した(P < 0.001、 P < 0.01)。これらの知見は、ストレスがラットの正常な生理学的代謝を阻害し、F群とQZF群が異常な代謝プロファイルに有意な改善と修正を示したことを示した(図2B)。

オープンフィールドテスト結果
28日間の介入後、4つのグループ間でオープンフィールドテストの総距離に有意差はありませんでした(P > 0.05)(図2D)。グループCONと比較して、グループCRSの中央領域で費やされる時間は有意に減少しました(P < 0.01)。CRS群と比較して、F群とQZF群の中央領域で過ごす時間は有意に増加しました( P 群<ともに0.01)。治療群間に有意差は認められなかった(P > 0.05)(図2C、E)。

強制水泳試験結果
28日間の介入後、CRSグループはCONグループと比較して不動時間が大幅に増加しました(P < 0.0001)。CRS群と比較して、F群とQZF群は不動時間を有意に短縮しました(P < 0.05、 P < 0.001)(図2F)。

ネットワーク薬理学予測

複合的な仮定を持つターゲット ネットワーク
QZF-compound-hypothetical target networkを構築するために、まずQZFの1,020の仮想ターゲットをスクリーニングし、それらをネットワーク解析ソフトウェアによって化合物ターゲットとして収集・可視化しました。ネットワークは1,184のノードと8,728のエッジを示しました（図3)³²。

QZFおよびうつ病のターゲットスクリーニング
GeneCardsデータベースから合計17,947のうつ病関連ターゲットが検索され、平均関連性スコアは1.105でした。その後、関連性スコアが 1.105(n = 5,048)を超えるターゲットを、さらなるデータ分析のために選択しました。ベン図は、QZFからの1,020のターゲットを使用して作成され、612の共通ターゲット(OGE)を取得しました(図4A)。612の共通ターゲットを解析のためにSTRINGデータベースにインポートし、PPIネットワークには607のノードと14,375のエッジが含まれ(図4B)、OGEをネットワーク解析ソフトウェアにインポートしてインタラクションネットワークを取得しました。

コア標的遺伝子のスクリーニング
MCODE プラグインを使用したモジュール分析により、MCODE スコアが 54.19029³¹ のスコアが最も高いクラスター モジュールが特定されました。クラスターハブモジュール内で、QZFの抗うつ薬効果に重要な64の主要なターゲットを特定しました(図4C)。CytoNCAプラグインを使用して、次数中心性(DC)、近接性中心性(CC)、および媒介性中心性(BC)の3つの中心性指標に基づいて、高度に接続されたノードをスクリーニングしました。具体的には、次数中心性は、ノードがネットワーク内で持つ直接接続の数を測定します。近接中心性は、ノードと他のすべてのノードとの間の平均最短パス長の逆数を定量化し、ノードが他のノードにどれだけ効率的にアクセスできるかを示します。媒介中心性は、ノードのすべてのペア間の最短パスにノードが出現する頻度を評価し、その仲介の役割を反映します。これらのメトリクスに基づいて、コアネットワークを構築し、最も接続性の高い上位10ノード(BCL2、AKT1、IL6、BCL2L1、MTOR、CASP3、TP53、STAT3、NFKB1、HIF1A)を特定しました(図4D)。データフィルタリングに続いて、これらの10の主要な標的遺伝子に対して機能的エンリッチメント解析を行い、それらの生物学的機能をさらに解明しました。

GOエンリッチメント分析
GOエンリッチメント分析では、合計2,783の注釈付き項目が得られ、そのうち2,385が統計的有意性を示しました。この解析は、主に生物学的プロセス(BP)、分子機能(MF)、および細胞成分(CC)のカテゴリーに影響を与えました。具体的には、GO-BPカテゴリーは2,450項目を含み、そのうち1,926項目が統計的に有意であると判断されました。分子機能(GO-MF)のカテゴリーでは184項目が同定され、そのうち117項目が統計的有意性を示した。細胞成分(GO-CC)のカテゴリーでは149項目が明らかになり、そのうち59項目が統計的に有意でした(図5)。

KEGG濃縮分析
KEGGのパスウェイエンリッチメント解析では、10の主要なターゲットに関連する合計156のパスウェイが特定され、そのうち119のパスウェイが統計的有意性を示しました。この図は、エンリッチメントスコアが最も高い上位20の経路を示しています(図6)。一部の関連疾患の除去により、HIF-1とJAK-STATの2つのシグナル伝達経路が残され、これらはQZFとうつ病の主要な経路であると予測されました。

QZFとうつ病の主要な標的経路ネットワーク
QZFとそのうつ病への影響との機構的関係を解明するために、私たちは極めて重要なTCM-化合物-標的-経路相互作用ネットワークを開発しました(図7)。ネットワーク解析ソフトウェアを利用して、最も重要なp値を持つシグナル伝達経路とそれに関連するターゲットを視覚化しました。結果のネットワーク グラフは、93 個のノードと 218 個のエッジで構成されていました。さらに、HIF-1およびJAK-STATのコアシグナル伝達経路に特に焦点を当てて、主要な遺伝子とそれに対応する活性化合物を表すサンキー図を作成しました(図8)。

分子ドッキング
分子ドッキング解析を採用して、化合物の標的特異性を実証しました。この手法は、リガンドとそのタンパク質標的との間の結合親和性を評価するもので、結合エネルギーの大きさが低いほど、リガンドの相互作用が強く、その結合部位に近接していることを示す³³。その結果、結合エネルギーはHIF1AとグリチルリチンフラボノールAが-8.7 kcal/mol、STAT3とジンセノサイドrh2が-8.5 kcal/mol、BCL2とイソリコフラボノールが-7.6 kcal/mmol、MTORとリコカルコンBが-6.8 Kcal/mol、AKT1とKaempferolが-6.7 Kcal/mol、IL6とリノレン酸が-5.2 Kcal/molであった。

全体として、分子ドッキングの結果は、化合物が標的に対して強い結合親和性を示すことを示しました。各タンパク質の結合エネルギーは次のように視覚化されます:白い漫画のパターンはタンパク質受容体を表し、青いものは低分子リガンド、黄色の点線はリガンドと受容体との間に形成される水素結合を示し、緑はタンパク質受容体と低分子リガンドとの間の水素結合の付着部位を表します。 そして、数字は水素結合距離を示しており、これはリガンドと受容体との間の結合が非常に安定していることを意味する(図9)³⁴。

図1:実験ラットのグループ化および行動試験のフローチャート。 略語:CRS =慢性拘束ストレス;QZF(Q)=qiangzhifang;F =フルオキセチン;OFT = オープンフィールドテスト;FST = 強制水泳試験;SPT = スクロース選好試験。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:CRS誘発ラットうつ病モデルに対するQZFの影響。 (A)0日目と28日目のショ糖消費量レベル(%)。(B)0日目と28日目の体重(g)。(C)4週目のオープンフィールドテストにおけるラットの軌跡のプロット。(D) 0日目と28日目のオープンフィールドの合計距離。(E) 第4週における各グループのOFTの中央エリアでの滞在期間。 ** P < 0.01は、CRSグループと比較して、FグループとQZFグループの間に有意差があることを示しています。(F)4週目の各グループのFST不動時間(%)。※ P < 0.01は、CRSグループと比較してFグループとの間に有意差があることを示しています。 P < 0.001 は、QZF グループが CRS グループと比較して有意な差を示したことを示します。略語:CRS =慢性拘束ストレス;QZF = qiangzhifang。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:QZF-Compound-Targetネットワーク。 緑色の三角形は、QZFの伝統的な漢方薬を示しています。円は伝統的な漢方薬の成分を示しています。ひし形はターゲットを示します。ピンクの矢印は、いくつかの漢方薬の共通成分を示しています。A(MOL000211)はBai shaoとZhi gan caoに関連しています。B(MOL000358)は、Bai shao、Chuan bei mu、Gu zhi、およびRen shenに関連付けられています。C(MOL000359)は、Bai shao、Chuan bei mu、Gui zhiと接続します。D(MOL000422)は、Bai shao、Zhi gan cao、およびRen shenに関係します。E(MOL000492)はBai shaoとGu zhiに関連しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:交差ターゲットの特定とコアターゲットのスクリーニング。 (A)QZFとうつ病の一般的なターゲットのベン図。薄緑色の円は、QZFの有効成分の標的タンパク質を表しています。青い円はうつ病に関連するタンパク質を示します。2つの色が交差する部分が重なり合っているのは、合計612個のタンパク質を共有していることを示しています。(B)QZFとうつ病のPPIネットワーク。(C)MCODE解析。(D)上位10のコアターゲット。略語:QZF = qiangzhifang;PPI = タンパク質間相互作用。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:一般的なターゲットのGOエンリッチメント分析のヒストグラム。 緑色のバーは生物学的プロセスを表しています。赤いバーは分子機能を表しています。青いバーは細胞成分を表しています。各バーの高さは、対応する GO 用語に関連付けられた遺伝子数を反映しています。略語:GO = Gene Ontology。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:うつ病におけるQZFの治療標的のKEGG濃縮経路。 (A) 上位 20 の経路を P 値でランク付けした棒グラフ。(B)上位20の経路のバブルチャート:ポイントサイズは遺伝子番号を示します。色の強度は、P値の有意性を反映します。(C)KEGG経路の機能的アノテーション。略称:KEGG=京都遺伝子・ゲノム大百科事典。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:TCM-compound-target-pathwayの相互作用ネットワーク。 赤はQZFとうつ病、紫はシグナル伝達経路、緑はコア経路タンパク質、黄色はQZF内の漢方薬、青は構成薬草化合物を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:HIF-1およびJAK-STATシグナル伝達経路に基づくQZFの抗うつ効果のTCM-compound-target-pathwayのサンキー図。 略語:QZF = qiangzhifang;TCM = 伝統的な中国医学;HIF-1 = 低酸素誘導因子-1;JAK-STAT = ヤヌス活性化キナーゼシグナル伝達剤および転写活性化因子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:分子ドッキングの検証結果。 (A) QZFの代表成分と標的タンパク質分子との結合エネルギー(kcal/mol)のヒートマップ (B) ドッキング状況の可視化略語:QZF = qiangzhifang。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:QZF伝統的な漢方薬顆粒の調製。 略語:QZF = qiangzhifang。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

CRSは、うつ病の動物モデルを確立するために広く使用されている方法です。このモデルは、人間の生活で遭遇する慢性的な心理的ストレスを模倣し、ラットにうつ病のような行動を誘発する³⁵。本研究では、ラットの拘束チューブを透明なプラスチックで構成し、動物の安全性を確保しつつ、実験中の明確な観察を可能にしました。透明なチューブは長さ約18cm、直径約6cmで、直径1cmの通気孔が複数設けられ、側面と蓋に沿って均一に配置されているため、ラットに十分な空気の流れが供給されています。ストレスを受けたラットは、うつ状態やうつろな目などの抑うつ症状を示し、うつ病に特徴的な行動変化を示しました。具体的には、これらの変化には、OFTでの運動活動の低下、FSTでの動かない時間の延長、SPTでのショ糖消費量の減少が含まれていました。これらの行動症状は、臨床的うつ病の患者に観察される運動緩慢、無快感症、および興味の喪失によく似ています。

うつ病の複雑な病理学的メカニズムを研究する文脈では、ネットワーク薬理学と分子ドッキング技術の組み合わせは、うつ病の治療における伝統的な漢方薬化合物の分子メカニズムを分析するための革新的な戦略を提供します。この研究では、うつ病の治療におけるQZFのコアターゲットとして、HIF1A、STAT3、BCL2、MTOR、AKT1、およびIL6が特定されました。これらの標的は、主にHIF-1およびJAK-STATシグナル伝達経路に富んでいました。これら2つのシグナル伝達経路は、神経炎症、酸化ストレス、アポトーシスなど、うつ病の主要な病理学的プロセスにおいて中心的な役割を果たします。

HIF-1シグナル伝達経路は、細胞の酸素代謝の中心的な調節メカニズムとして機能し、神経保護、抗酸化ストレス応答、血管新生など、さまざまな生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています³⁶。研究によると、うつ病患者の脳組織は、顕著な低酸素微小環境と酸化ストレス損傷を示しており、これらは神経炎症反応の活性化と神経伝達物質の不均衡と密接に関連している³⁷。Semenza氏の研究は、低酸素条件下で、HIF-1αが血管内皮増殖因子(VEGF)、エリスロポエチン(EPO)、ミトコンドリア遺伝子など、酸素代謝と抗酸化防御メカニズムに関連する遺伝子をアップレギュレートすることを示しています。その結果、これはミトコンドリア機能を強化し、脳の微小血管の形成を促進し、脳組織への酸素供給を増加させ、活性酸素種(ROS)の蓄積を減少させる³⁸。

さらなる実験的研究は、HIF-1α欠損症が酸化ストレスに対するニューロンの感受性を著しく高め、それによってアポトーシスシグナル伝達経路の異常な活性化を引き起こすことを示している³⁹。これにより、ニューロンのアポトーシスが大幅に増加し、認知機能が低下します。対照的に、トランスジェニックマウスモデルにおけるニューロン特異的HIF-1αの過剰発現は、ニューロンの生存率とシナプス密度の両方を有意に向上させる⁴⁰。これらの知見は、抗酸化防御機構におけるHIF-1αの重要な役割を実証するだけでなく、神経可塑性リモデリングの促進とシナプス構造の最適化を通じて、脳機能を強化するHIF-1αの治療的意義の可能性を強調しています。さらに、HIF-1シグナル伝達経路はNF-κBシグナル伝達経路に拮抗し、炎症性サイトカインIL-6およびTNF-αの産生の減少、神経炎症の抑制、および潜在的な神経保護効果および抗うつ効果の発現につながる⁴¹。

特に、QZFの有効成分の1つであるグリチルリチンフラボノールAは、抗酸化作用と抗炎症作用を示すことが確認されています。この研究では、分子ドッキングデータにより、リキリチゲニンAがHIF-1αタンパク質に対して高い結合親和性を示し、-8.7 kcal/molに達することが明らかになりました。この知見は、グリチルリチンフラボノールAがHIF-1αを直接標的とし、そのタンパク質安定性または転写活性を調節する可能性があることを強く示しています。その結果、HIF-1シグナル伝達経路内の酸素代謝と抗酸化防御に関与する遺伝子の発現を調節し、それによって低酸素条件下でのニューロンの生存を促進し、うつ病に関連する神経損傷を軽減します。

JAK-STATシグナル伝達経路は、サイトカインシグナル伝達の中心的なハブとして機能し、炎症調節、免疫応答調節、神経細胞の生存など、さまざまな生物学的プロセスにおいて極めて重要な役割を果たしています^42,43。広範な研究により、うつ病の病因はJAK-STATシグナル伝達経路⁴⁴の調節不全と複雑に関連していることが実証されています。Dowlatiらによって行われたメタアナリシスでは、健康な対照と比較して、IL-6やTNF-αなどの炎症誘発性サイトカインの血清レベルがうつ病患者で有意に増加し、抑うつ症状の重症度と正の相関があることが明らかになった⁴⁵。具体的には、これらの炎症誘発性因子はJAK-STAT経路を活性化し、それによって炎症反応を誘発することができます。このプロセスは、ニューロンやグリア細胞に直接的な損傷を誘発するだけでなく、シナプスの構造と機能を損ない、最終的には患者の認知的および感情的障害を悪化させます⁴⁶。

さらに、JAK-STAT経路の過剰な活性化は、ニューロンのアポトーシスと強く関連しています。持続的なSTAT3リン酸化は、カスパーゼファミリーのメンバーを含むアポトーシス促進遺伝子の発現をアップレギュレートし、最終的にニューロンの喪失をもたらします。さらに、この経路の異常な活性化は、海馬領域の神経新生を損ない、シナプスの可塑性を減少させ、それによって神経機能障害を悪化させる⁴⁷。本研究では、QZFの重要な活性成分であるジンセノサイドRh2が、分子ドッキング解析においてSTAT3タンパク質と有意な結合親和性を示しました。これらの知見に基づいて、ジンセノシドRh2は、STAT3の活性化を特異的に阻害し、それによって炎症誘発性サイトカインの産生および放出を減少させることにより、神経炎症反応を効果的に緩和する可能性がある⁴⁸。

HIF-1とJAK-STATという2つの主要なシグナル伝達経路に加えて、この研究では、QZFの抗うつ作用における他の活性成分と標的間の相乗的相互作用が同定されました。標準的な抗アポトーシスタンパク質であるBCL2は、細胞の生存を維持し、アポトーシスシグナル伝達経路を抑制する上で重要な役割を果たしている⁴⁹。QZFでは、イソリコフラボノールはBCL2タンパク質を特異的に標的化して活性化することにより、抗酸化および抗アポトーシス特性を示し、それによってニューロンのアポトーシスを効果的に阻害し、ニューロンを保護し、うつ病に関連する神経病理学的変化を改善します。さらに、うつ病患者における異常なMTORシグナル伝達経路は、ニューロン機能障害と強く関連しています⁵⁰。研究は、リコカルコンBがニューロンの成長と生存を促進し、MTORシグナル伝達経路⁵¹を調節することによりシナプスの可塑性と機能的結合性を強化し、それによって抗うつ効果を発揮することを実証しています。さらに、天然のフラボノイドであるケンフェロールは、その強力な抗酸化作用と抗炎症作用を特徴とし、AKT1シグナル伝達経路を特異的に活性化します。複数の主要な下流分子の制御を通じて、ニューロンの生存を促進するだけでなく、機能回復を促進し、QZFの抗うつ効果に対する追加の分子標的サポートを提供します。

要約すると、この研究では、ネットワーク薬理学と分子ドッキングを利用して、うつ病の治療におけるQZFの治療経路、コアターゲット、および効果的な活性成分を予測しました。QZFの抗うつ効果は、うつ病のラットモデルで検証され、HIF-1やJAK-STATなどの複数のシグナル伝達経路を調節し、神経炎症、酸化ストレス、アポトーシスなどの主要な病理学的プロセスを標的とすることにより、抗うつ効果を発揮する可能性があることが示唆されています。この知見は、うつ病の病態メカニズムの理解を深めるだけでなく、伝統的な漢方薬の処方をうつ病治療に応用するための理論的基盤と新たな治療標的を提供するものです。ただし、この研究にはいくつかの制限があります。QZFにおける複数の成分の相乗メカニズムは、まだ完全に解明されておらず、これらの成分のin vivo での代謝過程と相互作用については、さらなる研究が必要です。今後の研究では、 in vitro および in vivo 実験を液体クロマトグラフィー、ハイスループットシーケンシング、マルチオミクス統合などの先端技術と統合して、QZFの抗うつ効果に関連する主要な標的と経路を包括的かつ正確に特定し、ネットワーク薬理学を通じて行われた予測を検証および拡張する可能性があります。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

この研究は、中国国家自然科学基金会(82374311)、国家中医薬管理局高レベル伝統中国医学(TCM)基本理論主要分野建設プロジェクト(zyyzdxk-2023118)、国家伝統中国医学専門家スタジオ建設プロジェクト(全国中医学教育レターNo.75)、山東省自然科学基金会(ZR2022LZY016)の支援を受けました。QZF顆粒は、山東中医薬大学付属病院の医薬品部門によって調製されました。