토끼 근육에서 육-소포체 Ca²⁺-ATPase의 정제

이 프로토콜은 최종 원심분리 단계에서 이당류 트레할로스를 포함하는 개선된 SERCA 정제 방법을 설명합니다. 이 탄수화물은 가혹한 조건에서 단백질을 안정화시킵니다. 정제된 SERCA는 촉매 활성을 보였고 순도가 높았기 때문에 구조 및 기능 연구에 적합했습니다.

SARCO/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase(SERCA)와 같은 일부 P형 ATPase는 본질적으로 불안정한 막 단백질로, 높은 순도 및 구조적 품질로 촉매 활성 형태로 얻기 위해 정제 중에 특정 물리화학적 조건이 필요합니다. 이당류 트레할로스(trehalose)는 막과 단백질을 안정화하기 위해 효모 세포질에서 고농도로 합성되고 축적되는 호환 가능한 용질입니다. 원형질막 H⁺-ATPase의 정제를 위한 프로토콜에서 첨가제로 트레할로스를 사용하면 고품질 제제가 생성되며, 그 헥사메릭 구조는 생화학적 분석 방법으로 표시됩니다. 따라서 트레할로스는 막 단백질(P-ATPase)의 정제를 위한 안정화 첨가제로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 트레할로스 농도 구배에서 SERCA를 원심분리하여 SERCA 정제를 위한 기존 프로토콜의 수정을 설명합니다. 이 탄수화물의 포함은 SERCA의 순도가 높은 촉매 활성 형태로, 그리고 중요하게는 안정적인 형태로 정제되었습니다. 정제된 SERCA의 부분적인 생화학적 특성화(SDS-PAGE, 효소 반응속도학, FITC 라벨링, 원형 이색성 분광법)는 효소가 기능 및 구조 연구에 적합하다는 것을 보여주었습니다. P형 ATPase 및 기타 불안정한 막(및 세포소) 단백질의 정제 프로토콜에서 트레할로스의 사용이 제안됩니다.

막 단백질/효소는 다양한 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 세포의 필수적인 생물학적 구성 요소입니다 ^1,2,3. 일부 기능에는 세포/내부 구획(능동/수동) 안팎으로 이온 및 분자의 이동, 세포-세포 인식, 세포 간 결합, 고정/부착 및 정상적이고 가혹한 물리적 및 화학적 조건(고염, 저수, 고온, 약물 내성, 등)³ 그러므로, 막 단백질 및/또는 효소의 3차원(3D) 구조를 결정하는 것은 기초 및 응용 연구 ^4,7,6 모두에서 매우 중요해졌습니다. 중요한 것은 멤브레인 단백질/효소가 약물 발견(천연 또는 설계)의 표적으로 광범위하게 사용되어 왔다는 것입니다^7,8,9. 즉, 막 단백질은 건강에 본질적으로 중요합니다 ^9,10,11.

막 단백질/효소의 소수성 특성은 실험 실험실에서 기술적으로 가장 까다로운 물리화학적 특성이며, 12,13,14, 올리고머 및/또는 매우 불안정한 일체형 막 단백질^15,16으로 작업할 때 더욱 그렇습니다. 기능적 실험 분석 및 구조 연구를 위해 가능한 최고 품질의 막 단백질/효소를 적절한 양으로 분리하는 것이 매우 바람직하다¹⁷. 멤브레인 단백질은 본질적으로 소수성이기 때문에 정제하기가 매우 어렵고 세제의 선택은 일반적으로 고려해야 할 가장 중요한 문제 중 하나입니다 ^17,18,19,20. 이와 관련하여, 막 단백질을 분리하기 위해 사용되는 실험실 방법은 전형적으로 단백질(²¹)의 3D 구조 배열에 어느 정도의 손상을 일으킨다. 이러한 방법 중 일부에는 (a) 초음파 처리 (고주파 / 에너지 초음파), (b) 단백질 가용화 세제 (가혹, 중간 또는 부드러운) ²², (c) 컬럼 크로마토 그래피 및 고속 초 원심 분리에서 상대적으로 높은 압력²³, (d) 침전 분자, (e) 소화 효소 및 기타²¹. 이러한 모든 과정은 정제 중 단백질 불안정화에 기여하거나 주요 원인이 될 수 있습니다²¹. 이러한 점에서, 일부 프로토콜은 주어진 막 단백질에 대해 상대적으로 잘 작동하는 것으로 보입니다. 그러나 만족스러운 결과를 얻기 위해 더 높은 품질의 막 단백질 전처리가 필요한 새로운 최신 분석 또는 방법을 사용할 때 최적화는 항상 환영받습니다²⁴. 최적화 단계에는 구조 설계 개선, 막 단백질 발현을 위한 최적의 조건 찾기, 더 나은 취급 조건(즉, pH, 온도 등) 설정, 가장 적합한 세제 찾기, 초음파 처리 시간, 원심분리 속도와 같은 정제 단계 조정, 안정화제 첨가를 통한 완충액 재형성 등이 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않습니다.25,26,27. 따라서 정제된 멤브레인 단백질/효소의 품질(순도)과 활성을 증가시키는 정제 방법의 변경이 중요합니다.

P형 ATPase 계열에서 효모 원형질막 H⁺-ATPase는 가장 불안정한 구성원 중 하나로 보입니다^28,29. H⁺-ATPase는 탈수(동결 건조), 열 충격 등에 따라 ATP 가수분해 활성을 잃습니다.^28,29. 단백질 안정제로서의 트레할로스의 사용은 효모 K. lactis^30,31로부터 원형질막 H⁺-ATPase의 분리에서 시험되었다. 얻어진 H⁺-ATPase 제제는 순도가 높고 촉매 활성이었습니다. 중요한 것은, 이것은 효소의 올리고머 상태가 생화학적 방법으로 분해되어 헥사머로 밝혀지고 나중에 초저온 전자 현미경 31,32,33,34,35로 확인되었다는 것입니다. 그러므로, 막 단백질의 섬세한 3차원(3D) 배열은 정제³⁶ 동안 상대적으로 가혹한 조건 하에서 손실될 수 있는 것으로 보인다. 열 매개 불활성화 동안 H⁺-ATPase에 대해 Biphasic inactivation kinetic이 관찰됩니다²⁹. 다른 많은 유기체에서와 마찬가지로 효모 세포에서 이당류 트레할로스는 환경 스트레스 조건 하에서 고농도로 축적됩니다 37,38,39. Trehalose는 단백질(막 내장 및 세포소 모두)과 세포막을 안정화하여 막 무결성 및 수송 기능을 유지합니다^40,41. 트레할로스의 안정화 메커니즘은 여러 그룹과 본 연구실에서 광범위하게 연구되었습니다 ^42,43,44,45. H⁺-ATPase 및 다른 효소를 가진 실험은 trehalose가 mono- 및 disaccharides^28,29 중 가장 효과적인 단백질 안정제임을 보여주었다. 이로 인해 H⁺-ATPase 정제 프로토콜³⁰에 포함되었습니다. 최근에는 토끼 속경근에서 근망상 Ca²⁺-ATPase(SERCA)를 정화하는 데에도 트레할로스가 사용되어 단백질 순도와 활성이 우수한 결과를 보였다⁴⁶. 그러므로, trehalose는 P형 ATPases 및 아마 다른 막 및 cytosolic 단백질의 정화를 위한 좋고 적당한 첨가물인 것 같습니다.

P-ATPase의 경우, 구조적 세포질 도메인의 존재는 특히 기질/리간드 상호 작용 연구에서 실험적 이점입니다⁴⁷; ATP 결합은 고순도 재조합 N 도메인 ^47,48,49에서 연구되어 왔으며, 따라서 전막 효소 47,48,50 등의 정제에 대한 기술적 고려 사항을 제거했습니다⁵¹. 불행히도 일부 기능적(촉매/에너지 변환) 및 구조적(소단위 배열 및 다른 단백질과의 상호 작용) 연구에서는 여전히 전체 P-ATPase^52,53을 필요로 합니다. 이와 관련하여, SERCA의 정화는 여러 연구 그룹에 의해 달성되었습니다 54,55,56,57,58. 그러나, 개선은 여전히 구현될 수 있습니다⁴⁶, 예를 들어, 정제된 ATPase⁵⁹의 온전함을 증가시키고, 단백질 복합체의 변성/파괴를 피하고(²⁵), 막 단백질의 변성 없이 가용화를 증가시키고(즉, 고분자 응집체의 형성을 피함) ⁶⁰, 분석 및 기타 다운스트림 분석 방법과의 더 나은 호환성을 제공합니다⁶¹ 더욱이, 새로운 실험 전략, 첨가제, 효소 억제제 등이 과학 문헌 61,62,63,64,65,66에 나타나 있기 때문에 때때로 전체 P-ATPase로 테스트해야 합니다. 이 연구는 SERCA의 정제 및 단백질 구조 및 ATPase 활성을 안정화하기 위한 첨가제로 트레할로스를 사용하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 즉, 효소(구조적) 품질을 높이는 것 외에도 트레할로스는 효소 분리 및 저장 중 효소 구조 및 활성의 손실을 방지하는 데 도움이 되며, 이는 생물학적 물질을 저장하여 효소 정제 횟수를 줄이는 데 도움이 됩니다.

모든 동물 절차는 실험 실험실에서의 동물 취급에 대한 국제 및 지역(NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) 지침 51,67,68에 따라 수행되었습니다. 근육 조직은 지역 동물 취급 장치(INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)⁴⁶의 야생형 Oryctolagus cuniculus에서 얻었습니다. 실험실 동물 관리에 대한 전문 지식을 갖춘 수의사가 초기 근육 절제 및 처리를 수행했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 빠르게 움직이는 토끼 근육에서 근체망체의 분리(타이밍, 7 - 9시간)

참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Champeil et ^al.69를 참조하십시오.

1. 야생형 Oryctolagus cuniculus에서 속경 근육 조직(동물당 양쪽 뒷다리에서 ~70g)을 얻습니다.
   참고: 절개할 근육에 대한 사전 육안 식별이 필요합니다^70,71.
2. 빠르게 움직이는 근육을 믹서기에 100mM KCl의 3 볼륨으로 매달아 1 분 및 1 분 얼음처럼 차가운 휴식으로 3 회 반복⁷².
3. 4°C에서 5분 동안 원심분리(1500 × g)로 조직 파편을 제거합니다. 필요한 경우 두 번째 원심분리(4200 × g)를 수행합니다.
4. 상등액을 수집하고 조직 분쇄기(저속, 즉 500-1,500rpm에서 10회 스트로크)를 사용하여 균질화합니다^.72,73. 균질액(10,000 × g)을 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.
   알림: 상대적으로 높은 속도를 사용하면 시스템과 작업자가 손상될 수 있으므로 균질화할 때 주의해야 합니다.
5. 상층액(근소포체 함유)(33,000 × g)을 4°C에서 120분 동안 원심분리합니다.
6. 펠릿을 40mL의 수크로오스 0.5mL와 원심분리기(12,000× g)에 4°C에서 15분 동안 현탁합니다. 상층액(0.6 M KCl 및 0.15 M 자당)을 희석하고 현탁액(34,000 × g)을 4°C에서 165분 동안 원심분리한다.
7. 근질망 소포체(SRV) 시트를 포함하는 펠릿을 0.3M의 자당, 0.1M의 KCl 및 5mM의 Tris-HCl, pH 7.0에 현탁합니다. Lowry assay⁷⁴ 및 인간 혈청 알부민을 단백질 표준물질로 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
8. SRV(30-32 mg/mL)를 1 mL 용량으로 분주합니다. 추가 처리를 위해 SRV 샘플을 -72°C에서 보관하십시오.
   참고: 단백질 수율은 동물당 100-110mg SRV입니다.

2. SERCA 정화 (타이밍, 18 - 20 시간)

참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Rivera-Morán et ^al.46을 참조하십시오.

1. 얼음처럼 차가운 75mM의 Tris-HCl, pH 7.2, 0.6M의 KCl, 6mM의 EDTA, 1mM의 EGTA 및 0.1%(w/v) 데옥시콜레이트(DOC)를 사용하여 SRV 현탁액을 2mg protein/mL로 희석합니다. SRV 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양하고 부드럽게 교반합니다. SRV 현탁액(100,000 × g)을 4°C에서 60분 동안 원심분리기합니다.
   참고: DOC는 한 방울씩 추가해야 합니다.
2. 25mM의 Tris-HCl, pH 7.5, 0.3M의 KCl, 45% 글리세롤(v/v) 및 2mM EDTA <3mL에 펠릿을 현탁시킵니다. 현탁액을 균질화하고 최종 부피 10mL로 조정합니다. 단백질 농도를 측정한 다음 6.5mg/mL로 조정합니다. 5 mg/mL 및 0.85 (w/w) Zwittergent 3-14에서 아졸렉틴을 추가합니다.
   참고: Azolectin과 Zwittergent 3-14는 한 방울씩 추가해야 합니다.
3. 현탁액과 원심분리기(100,000 × g)를 4°C에서 60분 동안 균질화합니다. 상층액을 모아 2mM의 EGTA(pH 7.2)로 1:2로 희석합니다.
4. 10mM의 Tris-HCl, pH 7.0, 1mM의 EDTA, 0.1% 데옥시콜레이트 및 1mg/mL의 아졸렉틴에서 불연속 트레할로스 농도 구배(45, 40, 35 및 30% w/v)에 현탁액을 부드럽게 붓습니다. 원심분리기(100,000 × g) 4°C에서 14시간 동안. 튜브 바닥에 형성된 투명하고 약간 황색을 띤 펠릿을 수집합니다.
   참고: 트레할로스 구배의 형성과 샘플 현탁액의 추가는 모두 적절한 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 하룻밤 동안 원심분리하는 것이 좋습니다.
5. Tris-HCl 25mM, pH 7.5, M KCl 0.3, 글리세롤 45% 및 EDTA 2mM의 소량(<1.5mL)으로 펠릿을 부드럽게 현탁시킵니다. 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도를 2mg/mL로 희석하여 조정합니다. 현탁액의 부분 표본(~50 μL)을 취하고 정제된 SERCA를 사용할 때까지 -72 °C에서 보관합니다.
6. 정제된 SERCA⁷² 및 다양한 정제 단계에서 채취한 단백질 샘플의 SDS-PAGE를 수행합니다. Coomassie Blue⁷²로 젤을 염색합니다.
   참고: 현탁액에 글리세롤 대신 0.6M 트레할로스를 사용하면 저장 및 동결-해동 주기 동안 효소의 안정성이 증가합니다^28,29.

3. ATPase 활성에 대한 분석 (타이밍, 1 - 2 시간)

1. 효소 결합 분석법: ATPase-Piruvate kinase-lactate dehydrogenase
   1. 반응 혼합물 (1 mL)을 준비합니다 : 50 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 5 mM 포스포에놀피루베이트, 250 μM NADH. 다양한 ATP 농도(0.001 - 0.25mM)를 포함합니다.
   2. 와류(vortexing)에 의한 반응 분석을 조심스럽게 균질화합니다. 반응 분석을 37°C에서 10분 동안 배양하고 0.9U L-젖산 탈수소효소(LDH) 및 1.5U 피루브산 키나아제(PK)를 추가합니다.
   3. SERCA 10μg을 첨가하여 ATPase 반응을 시작합니다.
   4. NADH의 형성을 결정합니다. 온도 조절 셀 홀더가 있는 분광 광도계를 사용하여 시간이 지남에 따라 340nm의 파장(λ)에서 600초 동안 초당 흡광도 강도의 변화를 따릅니다.
      참고: 흡광도 측정을 위한 시간 간격은 다를 수 있지만 ATPase 반응의 초기 직선을 그리려면 가능한 한 많은 데이터 포인트를 기록하십시오.
2. ATP 가수분해 속도 측정
   참고: 절차에 대한 자세한 내용은 Rivera-Morán et ^al.46을 참조하십시오.
   1. 형성된 각 곡선에서 선형 부분의 기울기 값(Δabs/min)을 계산합니다. NADH(λ = 6,220 M⁻¹·cm⁻¹)의 몰 흡광 계수(ε)를 사용하여 ATPase 활성(μmoles ATP 가수분해/min.mg prot)을 측정합니다.
3. 동역학 매개변수 K_{, m} 및 V_max 결정
   1. 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 속도 대 ATP 농도를 플롯합니다.
   2. 비선형 회귀를 통해 데이터를 Michaelis-Menten 방정식(식 1)⁴⁶에 맞춥니다.
      
      여기서 v 는 속도, V_max 는 최대 속도, [S]는 ATP 농도, K_m 은 Michaelis-Menten 상수입니다.
   3. 반복을 통해 K_m 및 V_max 를 결정합니다.
      참고: DOC를 포함하면 ATPase 속도 반응이 증가할 수 있습니다. 최적을 찾기 위해 DOC의 다양한 농도를 테스트하는 것이 좋습니다.

4. FITC(Fluorescein Isothiocyanate)를 사용한 SERCA의 라벨링 분석(타이밍, 30 - 45분, FITC 라벨링에만 해당)

참고: 절차에 대한 자세한 내용은 54,75,76을 참조하십시오.

1. 1mM의 FITC를 포함하는 50mM의 라벨링 버퍼(100mM KCl, 5mM MgCl₂ 및 30mM Tris-HCl, pH 8.9)의 50μL(최종 부피)에 SERCA(20μg)를 현탁합니다. 소용돌이에 의하여 섞으십시오.
2. 어두운 곳과 실온에서 서로 다른 시간(15분, 10분, 7분, 5분, 2분)에 샘플을 배양합니다.
3. ATP(5mM)를 포함하는 1부피의 얼음-저온 정지 완충액(480mM의 자당 및 48mM의 MOPS, pH 7.0)을 첨가하여 라벨링 반응을 중지합니다. 어둠 속에서 5분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
4. FITC 라벨이 붙은 SERCA에 SDS-PAGE⁷²를 적용한다. 투명 젤을 자외선(λ = 302nm)에 노출시킵니다. 결과를 사진으로 문서화합니다.
5. 쿠마시 블루로 젤을 염색합니다. 결과를 사진으로 문서화합니다.
   참고: 어두운 방에서 FITC 라벨링을 수행하면 형광 신호의 품질이 향상될 수 있습니다.

5. 원형 이색성(CD) 스펙트럼(타이밍, 30분)

참고: 절차에 대한 자세한 내용은^11,77을 참조하십시오.

1. 25°C에서 400μL의 10mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 SERCA(3μM)를 현탁합니다.
2. 0.1cm 경로 길이 셀에 샘플을 로드합니다. 원자외선 스펙트럼 λ 범위를 190-260nm 사이로 설정합니다. 내부 해상도와 대역폭을 1nm로 설정합니다.
3. 25°C에서 50nm/min으로 CD 신호를 기록합니다.

다양한 정제 단계에서 SERCA의 SDS-PAGE(그림 1). Coomassie 파란색 염색 겔은 정제 프로토콜이 진행됨에 따라 SERCA 단백질 밴드(겉보기 분자량 >100kDa)가 풍부해지는 것을 보여줍니다. SERCA에 해당하는 단백질 밴드는 트레할로스 농도 구배에서 원심분리 후 >90%의 순도를 보여줍니다. ATP 가수분해 속도 대 ATP 농도의 플롯(그림 2A). ?...

대부분의 분자와 이온은 세포막을 자유롭게 통과 할 수 없으며, 예를 들어 양성자 (H ⁺)는 미토콘드리아^{83 , 84}와 같은 다양한 유기체 및 소기관의 원형질막에서 막 수송체를 필요로합니다. 세포막은 선택적이며 세포막을 가로지르는 분자와 이온이 다양하기 때문에 세포에서는 (a) ABC 수송체, (b) 이온 채널, (c) 막 결합 ATPas...

저자는 자신은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언한다.

저자는 비디오 편집에 Edmundo Mata-Morales, VM, SRV 정제에 Valentín de la Cruz-Torres, SERCA 정제 및 분석에 Miguel A. Rivera-Moran, 비디오 제작에 Juan C. Gonzalez-Castro, Franco E. Juarez, Alejandra Nevarez, Nicolas Rocha-Vizuet 및 Jocelin I. Ramírez-Alonso의 도움을 인정합니다. 이 연구를 수행하기 위한 자금, 보조금 또는 기타 지원을 받지 못했습니다.