Spatially Compact Arrangement of Larval Zebrafish Sections for Spatial Transcriptomic Analysis

여기에서는 여러 제브라피시(Danio rerio) 유충 샘플을 정렬 및 동결 절제하고 공간 전사체 분석을 위해 단일 슬라이드에 수집하는 방법을 제시합니다.

공간 전사체 기법은 공간적으로 등록된 유전자 발현 패턴을 시각화하기 위한 생물의학 연구의 정교한 도구입니다. 공간 이미징 플랫폼을 사용한 여러 샘플의 이미징 및 분석은 비용이 많이 들 수 있습니다. 개발 연구에서 볼 수 있듯이 여러 실험 조건에서 이러한 테스트를 수행하면 비용이 더욱 증가합니다. 비용을 줄이기 위해 이 연구는 발달 연구를 위한 공간 전사체 표본 배열의 기술과 전략을 최적화하고자 했습니다. 여기에서 이 연구는 발달 중에 투명하고 잘 정립된 발달 척추동물 모델인 제브라피시를 활용했으며, 인간과 ~70%의 유전적 상동성을 가지고 있으며, 전사체 분석에 이상적인 고도로 주석이 달린 게놈을 사용했습니다. 크기가 작기 때문에 제브라피시를 개발하면 여러 생물학적 복제물에 걸쳐 연속적인 단면을 조밀하게 배치할 수 있습니다. 여기서, 우리는 멀티플렉스 현장 혼성화 공간 이미징 플랫폼의 이미징 영역 내에서 여러 물고기 샘플의 최적화된 고정, 동결 절편 및 신뢰할 수 있는 정렬을 보고합니다. 이 방법을 사용하면 최소 4개의 서로 다른 주형과 최대 174개의 절편에서 최소 15일 후의 제브라피시를 성공적으로 동결 절제하고 22mm 10.5mm( 현장 공간 전사체 슬라이드의 경우)의 이미징 영역 내에서 수집하고 동시에 처리할 수 있습니다. 섹션 품질, 샘플 정렬 및 슬라이드당 샘플 크기를 기반으로 하는 제브라피시의 이 방법은 공간 전사체 기술의 출력 및 샘플당 비용을 최적화합니다.

조직에서 공간적으로 구별되는 발현 패턴에 대한 평가는 발달, 암 및 질병에 대한 게놈 영향에 대한 이해에 여전히 중요합니다 ^1,2,3. 공간 전사체학(spatial transcriptomics)은 다중화 발현 기법과 조직 내 발현의 공간 등록을 결합합니다. "공간 전사체학(spatial transcriptomics)"은 Ståhl과 동료들4에 의해 처음 만들어^{졌으며, 이} 용어에서는 현장 차세대 염기서열분석을 사용하여 장착된 암 표본을 조사했습니다. 그 이후로 "spatial transcriptomics"는 공간 정합과 결합된 고처리량 발현 연구를 위한 포괄적으로 사용되었습니다. 이러한 도구들은 강력한 도구이지만, 데이터를 생성하기 전에 대규모 기관 투자와 실험실 비용을 필요로 하는 비용이 많이 드는 작업이기도 합니다⁵. 고품질 데이터를 보존하면서 비용을 최소화하는 전략에 대한 수요가 높습니다.

제브라피시( Danio rerio)는 발달 생물학을 연구하기 위한 중요한 모델 시스템이 되었으며 제한된 공간에서 척추동물의 전체 장기(및 유기체) 분석을 증식시키는 수단을 제공합니다. 제브라피쉬는 작고(유충의 경우 4-6mm, 성충의 경우 2-3cm) 한 번에 수백 개의 투명한 알을 낳을 수 있습니다⁶. 제브라피시 배아는 외부에서 수정되고 빠르게 발달하기 때문에 연구자들은 발달 초기 단계에서 이식유전자를 도입하여 이득 및 기능 상실 대립유전자를 쉽게 생성할 수 있습니다⁷. 단일 슬라이드에 여러 시편을 장착하는 것은 비용을 절감할 수 있는 매력적인 전략입니다. 제브라피시는 높은 번식력과 작은 크기로 인해 표본을 위한 공간이 제한된 다중화 공간 전사체 분석에 이상적인 후보입니다⁸.

제브라피시 유충을 냉동 절제하는 것은 어려운 기술입니다. 많은 spatial transcriptomic 플랫폼은 제브라피시 파라핀 절편에 최적화되지 않았으며, 조직 구조를 보존하고 RNA 전사체를 유지하기 위해 제브라피시를 모델 유기체로 사용할 때 cryosection이 필요합니다. 또한 제브라피쉬의 크기가 작기 때문에 고품질 냉동 절편을 얻고 여러 샘플을 효과적으로 분석하기가 어렵습니다. 이 작업은 성체 유충보다 작고 연약한 제브라피시 유충으로 작업할 때 더 어려워집니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 여러 샘플을 안정적으로 정렬하고 공간 이미징 플랫폼의 이미징 영역을 효율적으로 활용하여 단일 슬라이드에서 많은 고품질 섹션을 얻은 다음 공간 이미징 플랫폼에서 이미지화하고 분석할 수 있는 방법을 설명합니다(그림 1). 이 경우 이 방법은 공간 전사체 이미징 플랫폼에 적용됩니다.

이 프로토콜은 다트머스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 저온 유지 장치 준비

1. 저온 유지 장치를 -22°C로 냉각하고 용기에 파편을 솔질하여 저온 유지 장치의 내부 표면을 청소합니다. 필요한 모든 브러시와 도구를 챔버 내부에 놓습니다.

2. 일회용 기본 금형 준비

1. 샘플 정렬을 위한 기준점으로 사용할 영구 마커가 있는 기본 몰드 내부를 가로질러 직선을 그려 샘플 정렬을 위한 기본 몰드(37mm, 24mm, 5mm 일회용 플라스틱 몰드)를 준비합니다. 최상의 결과를 위해 선을 그리기 전에 직선이 있어야 하는 베이스 몰드 내부에 실험실 테이프 조각을 놓습니다(그림 2A).
2. 바닥 몰드 내부의 왼쪽 또는 오른쪽 벽 근처에 점을 그려 동결 절편 중 적절한 시료 방향을 확인합니다(그림 2B).
3. 각도기로 원하는 절단 각도를 측정하고 각 샘플에 대한 기본 금형 내부에 이를 표시합니다(그림 2C).
4. 준비된 기본 주형에 얕은 층의 동결(광간섭 단층촬영[OCT]) 매체를 적용합니다. 샘플을 덮을 수 있을 만큼 충분한 냉동 매체가 있는지 확인하십시오.
   1. 매체가 전체 표면에 고르게 분포되도록 기본 금형의 수평면을 이동하기 전에 중간 병의 노즐을 프라이밍하고 기본 금형의 한쪽 모서리에 필요한 양의 매체를 추가하여 동결 매체를 적용할 때 기포를 방지합니다.
   2. 냉동 매체를 분배할 때 병을 천천히 짜십시오.
5. 1L 비커에 얼음을 넣고 얼음 수조에 냉동 매체가 있는 기본 금형을 놓고 매체를 냉각시키기 위해 최소 10분 동안 배양합니다.

3. 드라이 아이스 준비 : 100 % 에탄올 목욕

1. 얼음 양동이에 드라이 아이스 한 부분에 100% 에탄올 한 부분을 추가하여 흄 후드에 드라이 아이스와 100% 에탄올 수조를 준비합니다.
2. 일회용 알루미늄 접시를 사용하거나 알루미늄 호일을 일회용 기본 금형에 맞을 만큼 큰 보트에 접습니다. 접시나 보트가 기본 틀이 완전히 평평하게 놓일 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오.
3. 접시나 보트를 욕조에 넣고 양동이를 덮습니다. 샘플을 얼리기 전에 버킷이 식을 때까지 5-10분 정도 기다립니다.

4. 안락사 샘플

1. 단면화를 위해 제브라피시를 무작위로 선택합니다. 샘플의 크기가 다양한 경우 정확한 정렬을 더 쉽게 할 수 있도록 상대적 크기에 따라 그룹으로 분리하십시오(자세한 내용은 설명 참조). 큰 물고기와 작은 물고기를 별도의 접시에 담습니다.
2. 비커에 물고기 시스템의 물을 채우고 비커를 얼음 양동이에 넣습니다. 비커를 얼음으로 둘러쌉니다.
3. 온도계로 물의 온도를 모니터링하십시오. 온도를 2-4 °C 사이에서 안정화시킵니다.
4. 그물이나 거름망을 사용하여 한 그룹의 물고기를 4°C의 물에 넣습니다. 물고기는 물에 완전히 잠겨야 하며 얼음과 접촉하지 않아야 합니다. 수술 운동이 멈추면 물에 얼음을 넣어 4°C 미만으로 유지되도록 합니다. 물고기를 4°C의 물에 10분 동안 그대로 두십시오.
   참고: 다음 그룹을 안락사시키기 전에 안락사된 샘플의 각 그룹의 삽입, 정렬 및 급속 동결을 계속합니다. 매번 물을 교체하십시오.

5. 임베딩 및 정렬

1. 안락사된 물고기를 4°C의 물에 10분 동안 담근 후 수집합니다. 꼬리 지느러미를 잡고 끝이 가는 집게로 물고기를 물에서 꺼내고 흡수성이 있고 보푸라기가 없는 물티슈로 부드럽게 눌러 말립니다.
   참고: 고품질 섹션의 경우 4°C의 물에서 물고기를 꺼낸 것과 급속 동결 사이의 시간을 제한하는 것이 중요합니다
2. 준비된 기본 주형으로 실체 현미경(10배 배율)으로 얼음 수조에서 작업하고 각 샘플을 올바른 방향으로 기준점을 따라 기본 주형에 놓고 샘플을 다른 얇은 동결 매체 층으로 부드럽게 덮습니다.
   알림: 전체 금형을 냉동 매체로 채우지 마십시오. 대신 모든 샘플을 덮을 수 있을 만큼만 얇은 층을 사용하십시오.
3. 해부학적 기준점을 사용하여 물고기를 기본 금형 내부에 표시된 선에 정확하게 정렬합니다. 끝이 가는 집게를 사용하여 각 물고기의 방향을 조정하여 정렬되고 동일한 방향이 되도록 합니다. 천천히 움직여 동결 매체에 거품이 생기지 않도록 하십시오.
4. 샘플 아래의 기본 몰드 바닥에 드라이 아이스 조각을 국부적으로 동결 될 때까지 바릅니다. 드라이 아이스로 제자리로 얼기 전에 샘플이 기준점에서 벗어나지 않도록 기본 금형 레벨의 수평면을 유지하십시오.
5. 샘플이 든 기본 금형을 알루미늄 보트에 놓거나 드라이 아이스에 접시 : 100 % 에탄올 욕조에 담습니다. 보트가 수조 표면에 떠 있고 기본 곰팡이가 건조한 상태로 유지되는지 확인하십시오. 목욕을 덮고 샘플을 10분 동안 띄우십시오.
6. 냉동 베이스 몰드를 호일로 싸서 절단할 준비가 될 때까지 -80°C 냉동고에 보관합니다. 나머지 그룹에 대해 4.2-5.6단계를 반복합니다.

6. 냉동 절편

1. 동결 절편을 위해 동결된 베이스 몰드를 예냉된 저온 유지 장치에 넣고 저온 유지 챔버에 놓습니다. 얼어붙은 블록은 해동을 방지하기 위해 드라이아이스와 함께 상자에 넣어 운반하십시오.
2. 스토리지에서 현장 공간 이미징 슬라이드를 제거하고 미리 칠해진 슬라이드 홀더에 넣습니다. 관심 영역에서 절편을 수집할 준비가 될 때까지 -22°C 저온 유지 장치 챔버에 공간 이미징 슬라이드가 있는 슬라이드 홀더를 보관하십시오.
3. 기본 금형에서 냉동 샘플을 제거한 다음 새 냉동 매체를 사용하여 척에 얼립니다. 절단면이 칼날을 향하도록 척에 고정하십시오.
4. 신선하고 미세한 마이크로톰 블레이드를 저온 유지 장치에 놓습니다.
5. 금형을 블레이드에 정렬하고 관심 영역을 다듬습니다(권장 트림 두께 20-50μm). 금형 내부에 만들어진 표시가 샘플 내의 위치를 식별하는 데 도움이 되도록 얼어붙은 샘플 블록으로 전송되었는지 확인합니다.
6. 트리밍 단계에서 금형을 조정하여 절단 표면이 동결 매체의 참조 표시와 평행이 되도록 합니다.
7. 표준 양전하를 띤 현미경 슬라이드에 절편을 모으고 명시야로 확인하여 트리밍이 더 이상 필요하지 않은 시기를 확인합니다.
8. 저온 유지 장치 챔버에서 공간 이미징 슬라이드를 제거하고 4°C 얼음 수조에 넣습니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 보관하십시오. 슬라이드가 젖지 않도록 하십시오.
9. 동결 절편 시작(권장 10-14 μm; 그림 3) 샘플의 관심 영역에 도달할 때까지 양전하를 띤 슬라이드에 절편을 수집합니다. 명시야별 섹션을 확인하여 관심 영역이 금형의 다음 섹션이 될 것인지 확인합니다.
10. single-cell spatial imaging 슬라이드를 저온 유지 챔버로 다시 가져옵니다. 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 제거하고 섹션이 굴러가지 않도록 끝이 가는 페인트 브러시를 사용하여 정확한 관심 영역에서 공간 이미징 슬라이드로 한 줄씩 섹션을 수집합니다.
    1. 붓 뒷면으로 비어 있고 얼어붙은 매체의 모서리를 칼 스테이지로 눌러 수집을 위해 슬라이드를 잡을 때 섹션이 평평하게 유지되도록 합니다.
    2. 슬라이드 상단을 피벗 포인트로 사용하고, 슬라이드를 섹션 위로 천천히 내리고, 슬라이드를 나이프 스테이지에서 들어 올리기 전에 섹션이 슬라이드에 3초 동안 부착되도록 합니다.
    3. 슬라이드의 이미징 영역에서 섹션을 수집할 때는 왼쪽에서 오른쪽으로 작업하고 가능한 경우 비어 있고 동결된 매체의 레이어를 겹칩니다.
    4. 조직을 보기 어려운 경우 슬라이드의 이미징 영역 내에 섹션을 배치하기 위해 색종이 테두리를 참조로 사용합니다.
11. 관심 영역에서 섹션을 수집한 후 슬라이드를 슬라이드 홀더에 다시 놓습니다. 공간 이미징 슬라이드에 더 이상 수집할 샘플이 없는 경우, 현장 공간 이미징 플랫폼을 사용하여 기기를 분석할 준비가 될 때까지 최대 2주 동안 슬라이드를 -80°C에서 보관하십시오. 여러 금형에서 단면을 수집해야 하는 경우 공간 이미징 슬라이드를 4°C 얼음 수조에 다시 넣고 다음 금형에 대해 6.3-6.11 단계를 반복합니다.
12. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 위한 표준 양전하 현미경 슬라이드에서 각 금형의 관심 영역 절편 전후를 수집하여 분석을 진행하기 전에 샘플 정렬과 절편 품질이 충분한지 확인합니다.

7. 샘플 고정

1. 저온 유지 장치에서 기준 슬라이드를 제거하고 RT에서 30분 동안 자연 건조하여 슬라이드에 섹션을 부착합니다.
2. 4% 파라포름알데히드(표 1)가 포함된 슬라이드 용기에 20분 동안 섹션을 넣어 수정합니다.
3. 증류수와 함께 슬라이드 용기에 3분 동안 넣어 섹션을 세척합니다.
4. HE 염색을 계속하거나 건조시키고 향후 염색을 위해 슬라이드를 -80°C에서 보관하십시오.

8. 단면도의 HE 염색

1. 슬라이드를 100% 에탄올에 2분, 95%(표 2) 에탄올에 2분, 수돗물을 1분 동안 배양하여 섹션을 탈수하고 청소합니다. 현미경 슬라이드 염색 랙을 사용하여 수조에서 수조로 슬라이드를 옮깁니다.
2. 핵을 염색하고 슬라이드를 Hematoxylin에서 2분 45초, 수돗물을 1분, 0.3% 산성화 알코올(표 3)에서 1분 동안 배양한 다음 수돗물을 1분 동안 흘려서 구별합니다. 현미경 슬라이드 염색 랙을 사용하여 수조에서 수조로 슬라이드를 옮깁니다.
3. Eosin Y 1%에서 45초, 50% 에탄올(표 4)에서 1분, 95% 에탄올을 1분, 100% 에탄올에서 1분 동안 배양하여 세포질 성분을 염색하고 탈수합니다. 현미경 슬라이드 염색 랙을 사용하여 수조에서 수조로 슬라이드를 옮깁니다.
4. Xylene에서 슬라이드를 1분 동안 배양하여 섹션을 지웁니다. 전사 피펫으로 슬라이드의 상단 1/3에 장착 매체 한 방울을 바르고 집게로 장착 매체 상단의 커버슬립을 천천히 내려 슬라이드를 장착하고 덮습니다.

9. 단면도의 공간 transcriptomic 화상 진찰 그리고 분석

1. -80 °C 저장소에서 이미징 슬라이드를 제거하고 공간 전사체 분석을 위한 현장 공간 이미징 플랫폼으로 이미지화합니다.
   참고: 이미징과 관련된 정확한 단계는 공간 이미징 플랫폼에 의해 결정됩니다.
2. spatial transcriptomic platform의 품질 관리 메트릭을 검토하십시오. 확인해야 할 중요한 지표는 검출된 세포의 수, 세포당 중앙값 전사체, 100μm당 핵 전사체², 프로브 세트에 있는 각 유전자의 총 고품질 디코딩된 전사체입니다.
   참고: 이러한 품질 관리 지표에는 보편적인 임계값이 없으며 이러한 임계값에 대한 기대치는 사용하는 샘플 및 유전자 패널에 따라 달라집니다.
3. 검출 가능한 RNA 전사체의 데이터 출력을 읽고, 실험의 품질 관리 지표를 기반으로 어떤 전사체가 품질이 낮은지 결정하고, 품질이 낮은 전사체를 필터링합니다. 섹션 내의 공간 배열과 관련하여 나머지 고품질 대본을 분석합니다.
4. 실험적 관심 분야를 기반으로 한 절편과 클러스터 세포의 세포 분할을 볼 수 있습니다. 동일한 슬라이드에서 서로 다른 연령대의 제브라피시 그룹에 걸쳐 관심 영역의 세포 클러스터 내 RNA 전사체를 비교합니다.

이 방법(그림 1)에서 제브라피쉬는 공간적으로 분해된 유전자 발현 패턴을 조사하기 위한 동물 모델로 사용됩니다. 공간 이미징을 위해 유충 제브라피시를 효율적으로 냉동 절편하는 것은 어려운 일입니다. 절편은 조직 구조와 검출 가능한 유전자를 유지하기 위해 고품질이어야 합니다(그림 4). 공간적으로 효율적인 이미징을 ...

이 보고서는 개발 중 공간 전사체 분석에서 모델 유기체로서의 제브라피시와 관련된 많은 기술적 문제에 대한 자세한 솔루션을 제공합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 당사의 소형 검체 배열은 새로운 공간 전사체 플랫폼¹에서 비용을 최적화합니다. 공간 이미징을 위해 제브라피시 유충을 냉동 절편하는 것은 어려운 일입니다. 절편은 만족스러운 실...

저자는 이 보고서와 관련하여 어떠한 공개나 이해 상충도 없습니다.

절편 및 이미징은 NCI 암 센터 지원 보조금 5P30CA023108 및 다트머스 대학의 정량 생물학 센터(NIGMS COBRE)의 자금 지원을 받는 다트머스 암 센터의 공유 리소스에서 제공하는 기기를 사용하여 수행되었습니다.