الترتيب المضغوط مكانيا لأقسام اليرقات الزرد لتحليل النسخ المكاني

هنا ، نقدم طريقة لمحاذاة وتقطيع عينات يرقات متعددة من الزرد (Danio rerio) وجمعها على شريحة واحدة لتحليل النسخ المكاني.

تقنيات النسخ المكاني هي أداة متطورة في البحوث الطبية الحيوية لتصور أنماط التعبير الجيني المسجلة مكانيا. يمكن أن يكون تصوير وتحليل عينات متعددة باستخدام منصات التصوير المكاني مكلفا. يؤدي إجراء هذه الاختبارات على ظروف تجريبية متعددة ، كما هو موضح في الدراسات التنموية ، إلى زيادة التكاليف. لتقليل التكاليف ، سعت هذه الدراسة إلى تحسين تقنيات واستراتيجيات ترتيب عينات النسخ المكاني للدراسات التنموية. هنا ، استخدمت الدراسة أسماك الزرد ، وهي نموذج فقاريات تنموي راسخ وشفاف أثناء التطور ، وله ~ 70٪ تماثل جيني للبشر ، وجينوم مشروح للغاية مثالي لتحليل النسخ. نظرا لصغر حجمها ، يسمح تطوير أسماك الزرد أيضا بوضع مضغوط للأقسام التسلسلية عبر العديد من التكرارات البيولوجية. هنا ، نبلغ عن التثبيت الأمثل والتقطيع بالتبريد والمحاذاة الموثوقة لعينات الأسماك المتعددة داخل منطقة التصوير لمنصة التصوير المكاني للتهجين المتعدد في الموقع. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن بنجاح قطع أسماك الزرد التي يصل وزنها إلى 15 يوما بعد الإخصاب (dpf) من 4 قوالب مختلفة على الأقل وما يصل إلى 174 قسما ، وجمعها في منطقة التصوير 22 مم 10.5 مم (لشريحة النسخ المكاني في الموقع ) ، ومعالجتها في وقت واحد. استنادا إلى جودة القسم ومحاذاة العينة وحجم العينة لكل شريحة ، تعمل هذه الطريقة في أسماك الزرد على تحسين الإخراج وتكلفة العينة لتقنيات النسخ المكاني.

يظل تقييم أنماط التعبير المميزة مكانيا في الأنسجة أمرا بالغ الأهمية لفهمنا للتأثيرات الجينومية في التطور والسرطان والمرض^1،2،3. يجمع النسخ المكاني بين تقنيات التعبير المتعدد مع التسجيل المكاني للتعبير في الأنسجة. صاغ Ståhl وزملاؤه "النسخ المكانية" لأول^{مرة ، حيث} تم فحص عينات السرطان المركبة باستخدام تسلسل الجيل التالي في الموقع . منذ ذلك الوقت ، تم استخدام "النسخ المكانية" كصيد شامل لدراسات التعبير عالية الإنتاجية جنبا إلى جنب مع التسجيل المكاني. في حين أن هذه أدوات قوية ، إلا أنها أيضا مشاريع باهظة الثمن تتطلب استثمارات مؤسسية كبيرة وتكاليف معملية قبل إنشاء البيانات⁵. هناك طلب كبير على استراتيجيات تقليل التكلفة مع الحفاظ على البيانات عالية الجودة.

أصبحت أسماك الزرد ، Danio rerio ، نظاما نموذجيا مهما لدراسة علم الأحياء التنموي وتوفر وسيلة لمضاعفة تحليلات الأعضاء (والكائن الحي) للفقاريات بالكامل في مساحة محدودة. أسماك الزرد صغيرة (4-6 مم على شكل يرقات و 2-3 سم كبالغين) ويمكنها وضع مئات البيض الشفاف في وقت^{واحد 6}. يتم تخصيب أجنة الزرد خارجيا وتتطور بسرعة ، مما يسمح للباحثين بإدخال الجينات المعدلة وراثيا في المراحل المبكرة من التطور لتوليد أليلات كسب وفقدان الوظيفة^{بسهولة.} يعد تركيب عينات متعددة على شريحة واحدة استراتيجية جذابة لتقليل التكاليف. تجعل خصوبتها العالية وصغر حجمها من سمك الزرد مرشحا مثاليا لمضاعفة فحوصات النسخ المكانية التي قيدت مساحة العينات⁸.

يعد التقطيع بالتبريد ليرقات الزرد تقنية صعبة. لم يتم تحسين العديد من منصات النسخ المكانية لأقسام بارافين الزرد وتتطلب عمليات القطع بالتبريد عند العمل مع أسماك الزرد ككائن حي نموذجي للحفاظ على بنية الأنسجة والاحتفاظ بنصوص الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحجم الصغير لأسماك الزرد يجعل من الصعب الحصول على عمليات القطع بالتبريد عالية الجودة وتحليل عينات متعددة بشكل فعال. تصبح هذه المهمة أكثر صعوبة عند العمل مع يرقات الزرد الأصغر حجما والأكثر هشاشة من نظيراتها البالغة. للتغلب على هذه التحديات ، نصف طريقة تقوم بمحاذاة عينات متعددة بشكل موثوق وتستخدم منطقة التصوير لمنصات التصوير المكاني بكفاءة للحصول على العديد من الأقسام عالية الجودة على شريحة واحدة يمكن بعد ذلك تصويرها وتحليلها بواسطة منصات التصوير المكاني (الشكل 1). في هذه الحالة ، يتم تطبيق هذه الطريقة على منصة تصوير النسخ المكاني.

يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة رعاية واستخدامها المؤسسية في كلية دارتموث.

1. تحضير ناظم البرد

1. قم بتبريد ناظم البرد إلى -22 درجة مئوية وتنظيف الأسطح الداخلية لناظم التبريد عن طريق تنظيف الحطام بالفرشاة في الوعاء. ضع جميع الفرش والأدوات اللازمة داخل الغرفة.

2. تحضير قالب القاعدة القابل للتصرف

1. قم بإعداد قالب أساسي (قالب بلاستيكي يمكن التخلص منه 37 مم 24 مم 5 مم) لمحاذاة العينة عن طريق رسم خط مستقيم عبر الجزء الداخلي من قالب القاعدة بعلامة دائمة لاستخدامه كنقطة مرجعية لمحاذاة العينة. ضع قطعة من شريط المختبر داخل قالب القاعدة حيث يجب أن يكون الخط المستقيم قبل رسم خط للحصول على أفضل النتائج (الشكل 2 أ).
2. ارسم نقطة داخل قالب القاعدة بالقرب من الجدار الأيسر أو الأيمن لضمان اتجاه العينة المناسب أثناء القطع بالتبريد (الشكل 2 ب).
3. قم بقياس زاوية القطع المطلوبة بمنقلة وقم بتمييزها داخل القالب الأساسي لكل عينة (الشكل 2C).
4. ضع طبقة ضحلة من وسط التجميد (التصوير المقطعي للتماسك البصري [OCT]) على قالب القاعدة المعد. تأكد من وجود وسيط تجميد كاف لتغطية العينات.
   1. تجنب فقاعات الهواء عند تطبيق وسط التجميد عن طريق تحضير فوهة الزجاجة المتوسطة وإضافة الكمية اللازمة من الوسط إلى أحد أركان القالب الأساسي قبل إزاحة المستوى الأفقي للقالب الأساسي بحيث يتم توزيع الوسيط بالتساوي عبر السطح بأكمله.
   2. اضغط على الزجاجة ببطء عند توزيع وسط التجميد.
5. أضف الثلج إلى دورق سعة 1 لتر ، ضع القالب الأساسي بوسط تجميد في الحمام الجليدي ، واحتضنه لمدة 10 دقائق على الأقل لتبريد الوسط.

3. تحضير الثلج الجاف: حمام الإيثانول 100٪

1. قم بإعداد حمام ثلج جاف وإيثانول بنسبة 100٪ في غطاء دخان عن طريق إضافة جزء واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى جزء واحد من الثلج الجاف في دلو ثلج.
2. استخدم طبقا من الألومنيوم يمكن التخلص منه أو قم بطي رقائق الألومنيوم في قارب كبير بما يكفي ليناسب قالب قاعدة يمكن التخلص منه. تأكد من أن الطبق أو القارب كبير بما يكفي لوضع القالب الأساسي بشكل مسطح تماما.
3. ضع الطبق أو القارب في الحمام وقم بتغطية الدلو. اترك 5-10 دقائق حتى يبرد الدلو قبل تجميد العينات.

4. القتل الرحيم للعينات

1. حدد سمك الزرد بشكل عشوائي للتقسيم. إذا اختلفت العينات في الحجم ، فقم بفصلها إلى مجموعات حسب الحجم النسبي لتسهيل المحاذاة الدقيقة (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل). ضع الأسماك الكبيرة والأسماك الصغيرة في أطباق منفصلة.
2. املأ دورق بماء نظام السمك وضع الدورق في دلو ثلج. أحط الدورق بالثلج.
3. راقب درجة حرارة الماء باستخدام مقياس حرارة. دع درجة الحرارة تستقر بين 2-4 درجة مئوية.
4. استخدم شبكة أو مصفاة لوضع مجموعة واحدة من الأسماك في الماء 4 درجات مئوية. يجب أن تكون الأسماك مغمورة بالكامل في الماء وعدم ملامسة الجليد. بمجرد توقف الحركة التشغيلية ، أضف الثلج إلى الماء للتأكد من بقائه أقل من 4 درجات مئوية. اترك السمك في ماء 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: استمر في التضمين والمحاذاة والتجميد السريع لكل مجموعة من العينات التي تم القتل الرحيم قبل القتل الرحيم للمجموعة التالية. استبدل الماء في كل مرة.

5. التضمين والمحاذاة

1. اجمع الأسماك التي تم قتلها رحيما بعد غمرها في ماء 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. أخرج السمك من الماء باستخدام ملقط ناعم عن طريق الإمساك به من الزعنفة الذيلية وجففه بالضغط عليه برفق على منديل ماص وخالي من النسالة.
   ملاحظة: بالنسبة للأقسام عالية الجودة ، من الأهمية بمكان تحديد الوقت بين إزالة الأسماك من الماء 4 درجات مئوية والتجميد السريع
2. العمل مع قالب القاعدة المحضر في حمام جليدي تحت مجهر مجسم (تكبير 10x) ، ضع كل عينة في القالب الأساسي على طول النقاط المرجعية في الاتجاه الصحيح وقم بتغطية العينات برفق بطبقة رقيقة أخرى من وسط التجميد.
   ملاحظة: لا تملأ القالب بالكامل بوسط التجميد. بدلا من ذلك ، استخدم طبقة رقيقة فقط ، تكفي فقط لتغطية جميع العينات.
3. استخدم نقطة مرجعية تشريحية لمحاذاة السمكة بدقة مع الخطوط المحددة داخل قالب القاعدة. استخدم ملقطا دقيقا لضبط اتجاه كل سمكة بحيث تكون محاذاة وفي نفس الاتجاه. تجنب تكوين فقاعات في وسط التجميد عن طريق التحرك ببطء.
4. ضع قطعة من الثلج الجاف في قاع قالب القاعدة أسفل العينات حتى يتم تجميدها محليا في موضعها. حافظ على المستوى الأفقي لمستوى القالب الأساسي لتجنب إزاحة العينات من نقاطها المرجعية قبل التجميد إلى موضعها مع الثلج الجاف.
5. ضع القالب الأساسي مع العينات على قارب أو طبق من الألومنيوم في الثلج الجاف: حمام الإيثانول بنسبة 100٪. تأكد من أن القارب يطفو على سطح الحمام وأن القالب الأساسي يظل جافا. قم بتغطية الحمام واترك العينات تطفو لمدة 10 دقائق.
6. لف قالب القاعدة المجمد بورق القصدير واحفظه في فريزر -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتقسيم. كرر الخطوات 4.2-5.6 لأي مجموعات متبقية.

6. التقطيع بالتبريد

1. أحضر قوالب القاعدة المجمدة إلى ناظم البرد المبرد مسبقا للتقطيع بالتبريد وضعها في حجرة ناظم البرد. انقل الكتل المجمدة في صندوق به ثلج جاف لمنع الذوبان.
2. قم بإزالة شريحة التصوير المكاني في الموقع من التخزين وضعها في حامل شرائح مبرد مسبقا. قم بتخزين حامل الشريحة مع شريحة التصوير المكاني في غرفة ناظم التبريد -22 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لجمع الأقسام من المنطقة المعنية.
3. قم بإزالة العينات المجمدة من القالب الأساسي ثم قم بتجميدها في ظرف بوسط تجميد جديد. قم بتجميدها على ظرف بحيث يواجه سطح القطع الشفرة.
4. ضع شفرة ميكروتوم جديدة ودقيقة في الثلاجة.
5. قم بمحاذاة القالب مع الشفرة وقم بقص منطقة الاهتمام (سمك القطع الموصى به 20-50 ميكرومتر). تأكد من نقل العلامات التي تم إجراؤها داخل القالب إلى كتلة العينة المجمدة للمساعدة في تحديد الموقع داخل العينات.
6. اضبط القالب أثناء مرحلة التشذيب بحيث يكون سطح القطع موازيا للعلامات المرجعية في وسط التجميد.
7. اجمع الأقسام على شريحة مجهر قياسية موجبة الشحنة وتحقق منها عن طريق الحقل الساطع للتأكد من عدم الحاجة إلى التشذيب.
8. قم بإزالة شريحة التصوير المكاني من غرفة التبريد وضعها في حمام جليدي 4 درجات مئوية. احتفظ بالشريحة في حامل الشريحة. تأكد من أن الشريحة لا تبلل.
9. ابدأ التشريح بالتبريد (يوصى به 10-14 ميكرومتر ؛ الشكل 3) وجمع الأقسام على شرائح موجبة الشحنة حتى يتم الوصول إلى منطقة الاهتمام في العينات. تحقق من الأقسام حسب الحقل الساطع لتأكيد أن منطقة الاهتمام ستكون القسم التالي من القالب.
10. أعد شريحة التصوير المكاني أحادية الخلية إلى غرفة ناظم البرد. قم بإزالة الشريحة من حامل الشريحة وقم بتجميع الأقسام من منطقة الاهتمام الدقيقة إلى شريحة التصوير المكاني صفا تلو الآخر باستخدام فرشاة رسم ذات رؤوس دقيقة لمنع المقاطع من التدحرج.
    1. اضغط على زاوية من الوسط الفارغ المتجمد في مرحلة السكين مع الجانب الخلفي من فرشاة الرسم حتى يظل القسم مسطحا عند الإمساك بالشريحة للتجميع.
    2. استخدم الجزء العلوي من الشريحة كنقطة محورية ، وقم بخفض الشريحة ببطء على القسم ، واترك الأقسام تلتصق بالشريحة لمدة 3 ثوان قبل رفع الشريحة عن مرحلة السكين.
    3. اعمل من اليسار إلى اليمين عند تجميع الأقسام في منطقة التصوير للشريحة وتداخل طبقات الوسط الفارغ المتجمد عندما يكون ذلك ممكنا.
    4. استخدم حدود الورق الملونة كمرجع لوضع الأقسام داخل منطقة التصوير في الشريحة إذا كان من الصعب رؤية الأنسجة.
11. بعد جمع الأقسام من منطقة الاهتمام ، ضع الشريحة مرة أخرى في حامل الشريحة. إذا لم يكن هناك المزيد من العينات التي سيتم جمعها على شريحة التصوير المكاني ، فقم بتخزين الشريحة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين حتى تصبح جاهزة لتحليل الأداة باستخدام منصة التصوير المكاني في الموقع . إذا كانت هناك حاجة إلى جمع الأقسام من قوالب متعددة ، فضع شريحة التصوير المكاني مرة أخرى في الحمام الجليدي 4 درجات مئوية وكرر الخطوات 6.3-6.11 مع القالب التالي.
12. اجمع الأقسام قبل وبعد أقسام منطقة الاهتمام من كل قالب على شريحة مجهرية قياسية موجبة الشحنة لتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين (HE) للتحقق من أن محاذاة العينة وجودة القسم كافية قبل متابعة التحليل.

7. إصلاح العينة

1. قم بإزالة الشرائح المرجعية من ناظم البرد وجففها في الهواء عند RT لمدة 30 دقيقة لتلتصق الأقسام بالشريحة.
2. قم بإصلاح الأقسام عن طريق وضعها في حاوية منزلقة تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (الجدول 1) لمدة 20 دقيقة.
3. اغسل الأقسام عن طريق وضعها في وعاء منزلق بالماء المقطر لمدة 3 دقائق.
4. استمر في تلطيخ HED أو تجفيفه وقم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية للتلطيخ في المستقبل.

8. تلطيخ الأقسام

1. قم بتجفيف وتنظيف الأقسام عن طريق احتضان الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين ، و 95٪ (الجدول 2) الإيثانول لمدة دقيقتين ، ثم ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة. استخدم رف تلطيخ منزلق مجهر لنقل الشرائح من الحمام إلى الحمام.
2. قم بتلطيخ النوى وتمييزها عن طريق احتضان الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين و 45 ثانية ، وماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة ، والكحول المحمض بنسبة 0.3٪ (الجدول 3) لمدة دقيقة واحدة ، ثم تشغيل ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة. استخدم رف تلطيخ منزلق مجهر لنقل الشرائح من الحمام إلى الحمام.
3. تلطيخ المكونات السيتوبلازمية وتجفيفها عن طريق احتضان الشرائح في Eosin Y 1٪ لمدة 45 ثانية ، و 50٪ إيثانول (الجدول 4) لمدة دقيقة واحدة ، و 95٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة ، و 100٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة. استخدم رف تلطيخ منزلق مجهر لنقل الشرائح من الحمام إلى الحمام.
4. امسح الأقسام عن طريق احتضان الشرائح في الزيلين لمدة 1 دقيقة. قم بتركيب الشرائح وتغطيتها عن طريق تطبيق قطرة من وسط التثبيت على الثلث العلوي من الشريحة باستخدام ماصة نقل وخفض الغطاء ببطء أعلى وسط التثبيت باستخدام ملقط.

9. التصوير النسخي المكاني وتحليل الأقسام

1. قم بإزالة شرائح التصوير من التخزين والصورة -80 درجة مئوية باستخدام منصة التصوير المكاني في الموقع لتحليل النسخ المكاني.
   ملاحظة: سيتم تحديد الخطوات الدقيقة المتضمنة في التصوير بواسطة منصة التصوير المكاني.
2. مراجعة مقاييس مراقبة الجودة لمنصة النسخ المكاني. المقاييس المهمة التي يجب التحقق منها هي عدد الخلايا المكتشفة ، ومتوسط النصوص لكل خلية ، والنصوص النووية لكل 100 ميكرومتر² ، وإجمالي النصوص عالية الجودة التي تم فك تشفيرها لكل جين في مجموعة المسبار.
   ملاحظة: لا تحتوي مقاييس مراقبة الجودة هذه على عتبات عالمية ، وستختلف التوقعات لهذه العتبات اعتمادا على العينة ولوحة الجينات المستخدمة.
3. اقرأ إخراج البيانات لنصوص الحمض النووي الريبي التي يمكن اكتشافها ، وحدد النصوص ذات الجودة المنخفضة بناء على مقاييس مراقبة الجودة للتجربة ، وقم بتصفية النصوص منخفضة الجودة. تحليل النصوص المتبقية عالية الجودة فيما يتعلق بترتيبها المكاني داخل القسم.
4. عرض التجزئة الخلوية للأقسام وخلايا نظام المجموعة استنادا إلى الاهتمامات التجريبية. قارن نصوص الحمض النووي الريبي داخل مجموعات الخلايا في المنطقة ذات الاهتمام عبر مجموعات من أعمار مختلفة من أسماك الزرد على نفس الشريحة.

في هذه الطريقة (الشكل 1) ، يتم استخدام سمك الزرد كنموذج حيواني للتحقيق في أنماط التعبير الجيني التي تم حلها مكانيا. يعد التقطيع بالتبريد ليرقات الزرد بكفاءة للتصوير المكاني أمرا صعبا. يجب أن تكون الأقسام عالية الجودة للاحتفاظ ببنية الأنسجة والجينات التي ?...

يقدم هذا التقرير حلولا مفصلة للعديد من التحديات التقنية المرتبطة بأسماك الزرد ككائن حي نموذجي في تحليل النسخ المكاني أثناء التطوير. في مواجهة هذه التحديات ، يعمل ترتيب العينات المدمجة لدينا على تحسين التكاليف على منصات النسخ المكانية الناشئة¹. يعد استئصال ...

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات أو تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا التقرير.

تم إجراء التقسيم والتصوير باستخدام الأدوات التي توفرها الموارد المشتركة في مركز دارتموث للسرطان ، بتمويل من منحة دعم مركز السرطان NCI 5P30CA023108 ، ومركز البيولوجيا الكمي في كلية دارتموث (NIGMS COBRE).