박테리아 당단백질을 위한 비특이적 단백질 분해 기반 글리코믹스 전략

본 연구는 프로나제 E 분해, 과메틸화 및 질량 분석 분석의 조합에 의한 당단백질의 당체학 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 박테리아 N-글라이칸을 포함한 모든 유형의 N-결합 글라이칸을 분석할 수 있습니다.

단백질 당화(glycosylation)는 가장 일반적이고 복잡한 번역 후 변형(post-translational modification) 중 하나입니다. 글라이칸의 특정 역할, 글리칸 구조 간의 관계 및 단백질 기능에 대한 영향 간의 관계를 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 글라이칸 분석을 위한 일반적인 방법은 엑소글리코시다아제 절단을 사용하여 펩타이드-N-글리코시다아제 F(PNGase F)를 사용하여 당단백질 또는 글리코펩타이드에서 N-결합 글라이칸을 방출하는 것입니다. 그러나 박테리아의 글라이칸-단백질 연결은 다르며 박테리아 당단백질에서 글리칸을 방출하는 데 사용할 수 있는 효소는 없습니다. 또한 유리 글리칸은 포유류 세포, 박테리아, 효모, 식물 및 어류에서도 설명되었습니다. 이 논문에서는 표적 단백질에 부착되지 않은 아스파라긴(Asn) 결합 및 유리 글라이칸을 검출하여 Campylobacter jejuni의 N-결합 당화 시스템을 특성화할 수 있는 방법을 제시합니다. 이 방법에서 C. jejuni의 총 단백질은 효소 대 단백질 비율이 더 높고(2:1-3:1) 배양 시간이 더 긴 Pronase E(48-72시간)로 분해되었습니다. 생성된 Asn-글리칸 및 유리 글리칸을 다공성 그래파이트 탄소 카트리지를 사용하여 정제하고 과메틸화하고 질량 분석법으로 분석했습니다.

단백질 N-글리코실화(protein N-glycosylation)는 진핵생물에서 가장 일반적이고 복잡한 번역 후 변형(post-translational modification) 중 하나입니다¹. N-글리칸은 단백질 접힘에 필수적인 역할을 하며 생합성 트래픽에서 단백질 분류에도 영향을 미칩니다². 질량분석법은 엑소글리코시다아제 절단(당체학)에 의해 방출되는 글라이칸 분석에 널리 사용되었습니다. 나머지 탈글리코실화 펩타이드(glycoproteomics)는 진핵생물에서 글리코실화 펩타이드의 서열을 확인하는 데 일반적으로 사용되어 왔습니다³. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에서 N-결합 글라이칸의 확인은 N-글리코실화가 진핵생물 ^4,5,6,7,8에 국한되지 않음을 시사했습니다. 그러나 박테리아의 경우 글라이칸 분석을 위해 올리고당을 방출하는 효과적인 외글리코시다아제 또는 엔도글리코시다아제가 부족합니다.

당단백질의 당화(glycosylation) 부위와 글라이칸 구조를 특성화하기 위한 대안적인 접근법이 개발되었는데, 이는 비특이적 단백질 분해를 사용하여 대부분의 펩타이드의 골격을 소화하고 소수의 아미노산만 포함하는 유사 올리고당을 생성하는 것을 기반으로 합니다. 유사 올리고당을 생성하기 위해 다양한 비특이적 효소가 사용되었으며, Pronase E가 가장 효율적이고 재현 가능한 분해를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다⁹. 우리는 C. jejuni N-glycans^10,11을 분석하기 위해 Pronase E를 기반으로 하는 당체학 전략을 개발했습니다. 유사 올리고당은 모세관 전기영동 질량 분석법(CE-MS) 및/또는 과메틸화 후 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)으로 직접 분석했습니다.

여기에서는 비특이적 Pronase E 분해 및 과메틸화를 사용하여 점막 병원균 C. jejuni의 당화(glycosylation)를 연구하는 당체학(glycomics) 분석을 위한 보편적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 진핵 생물 및 박테리아 시스템 모두에서 발현되는 N-결합 글라이칸을 특성화할 수 있으며 N-연결 당화(glycosylation) 경로에서 새로운 중간체를 식별하는 데에도 유용합니다.

1. C. jejuni 11168H의 배양 및 총단백질 추출

참고: C. jejuni 11168H는 NCTC 11168¹²의 hypermotile clonal derivative이다.

1. 세포 펠릿(약 0.15g, NCTC)을 약 5mL의 Mueller-Hinton 배양 배지로 재수화하여 세포 배양을 시작합니다. 기본 육수 튜브를 몇 방울 떨어뜨려 Mueller-Hinton 한천 플레이트를 접종합니다. 37 ° C에서 18 시간 동안 미세 호기 성 대기, 즉 5 % O₂, 10 % CO₂ 및 85 % N₂ 에서 배양합니다.
2. 세균성 잔디밭에 뇌심장주입(Brain Heart Infusion, BHI) 육수 1mL를 수확합니다. BHI 육수로 수확물을 약 1 x 10⁵ c.f.u./mL에 도달하도록 희석합니다. 37°C의 미호기성 분위기에서 진탕(100rpm)으로 18시간 동안 세포를 성장시킵니다.
3. 플레이트를 얼음 위에 올려 10분 동안 세포를 식힌 후 원심분리(4°C에서 4,500 x g )로 세포를 수확합니다. 상등액을 버리고 얼음처럼 차가운 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8)의 3 L에서 세포를 2x 세척합니다.
4. 8 mL의 얼음처럼 차가운 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8)에 세포 (10,^8-10,¹¹ C. jejuni 세포)를 재현 탁시키고 초음파 처리에 의해 용해시킵니다 (재료 표). 다음과 같이 초음파 처리를 수행합니다 : 4 초 펄스, 1 초 꺼짐, 매번 1 분, 총 3 번.
5. 9,500 x g 에서 4°C에서 45분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 다른 튜브로 옮깁니다. 상등액의 단백질을 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)에 대해 4 시간 동안 4 °C에 대해 2x 투석합니다.
6. 시판되는 단백질 분석¹³ (4 - 6 μg/μL 범위)으로 단백질 농도를 측정합니다.
7. 1mL의 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 단백질 1mg을 용해하고 용액에 Pronase E 2.5mg을 첨가합니다. 37°C에서 48시간 동안 배양한 다음 용액을 100°C에서 5분 동안 끓여 효소를 비활성화합니다.
8. 추가 사용을 위해 단백질 분해 용액을 -80°C에 보관하십시오.

2. 다공성 흑연 탄소(PGC)를 사용한 정제

1. 0.1% 트리플루오아세트산(TFA)을 함유한 80%(v/v) 아세토니트릴(ACN) 1mL를 첨가하여 PGC 카트리지(100mg, 5mL)를 활성화하고 2회 반복합니다.
2. PGC 카트리지를 물 1mL로 3회 세척합니다.
3. 단백질 1mg에서 Pronase E 분해를 PGC에 로드합니다(부피는 단백질 농도에 따라 다름).
4. 염분을 제거하기 위해 매번 1mL의 물로 카트리지를 3번 세척하십시오.
5. 0.1% TFA에 25% ACN 1mL로 Asn-글라이칸을 용리한 다음 0.1% TFA에 50% ACN 1mL를 용리합니다.
6. 두 분획을 모두 풀링하고 추가 처리를 위해 냉장 진공 농축기(Table of Materials)로 샘플을 건조시킵니다.
   참고: Asn-글라이칸 정제를 위해 MS 등급 용매를 사용하십시오.

3. Asn-글리칸의 과메틸화

1. 건조된 Asn-글라이칸을 1.5mL 튜브에 100μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 용해합니다.
2. NaOH 펠릿 2개와 DMSO 2mL를 혼합하여 DMSO-NaOH 슬러리를 준비합니다. 시료에 DMSO-NaOH 슬러리 200μL와 요오드화 메틸 100μL를 추가합니다.
3. 튜브를 단단히 덮고 와류 믹서를 사용하여 실온에서 3,000rpm으로 10분 동안 저어줍니다.
4. 물 1mL를 추가하여 과메틸화를 담금질합니다.
5. 클로로포름 1mL와 볼텍스를 1분 동안 첨가하여 과메틸화 Asn-글리칸을 추출합니다.
6. 9,000 x g에서 3분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 과메틸화 Asn-글리칸으로 하부 클로로포름 상을 유지하십시오.
7. 물 1mL를 넣고 1분 동안 와류로 유기층을 세척합니다. 9,000 x g 에서 3분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 2회 반복합니다.
8. 유기상을 흄 후드에 놓고 실온에서 질소 흐름으로 건조시킵니다.
9. 질량 분석 분석을 위해 과메틸화 Asn-글라이칸을 -80°C에서 보관하십시오.

4. 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS) 및 ESI-MS/MS 분석

1. 과메틸화 Asn-글리칸을 50% 2-프로판올 20μL에 용해시킵니다(v/v).
2. 1μL/분의 속도로 물에서 50% 2-프로판올의 피복 흐름으로 90cm 베어 용융 실리카 모세관을 사용하여 CE-ESI-MS 분석을 수행합니다.
   참고: CE-MS는 모세관 전기영동(CE)과 질량 분석법을 결합한 시스템입니다. CE는 이온 이동도에 따라 이온을 분리합니다. 이 프로토콜에서 CE 시스템은 미세한 양의 샘플을 도입하고 온라인 탈염을 수행하는 데 사용됩니다.
3. 포지티브 모드에서 ESI 전압을 5kV로 설정합니다.
4. 약 100nL에 해당하는 0.2분 동안 500mbar에서 과메틸화 Asn-글라이칸 샘플을 로드합니다.
5. 다음 수집 매개변수를 사용하여 질량 분석기(Table of Materials)를 사용하여 MS 데이터를 획득합니다.
   1. 전체 MS의 경우 0.1m/z 단위의 단계당 2.0ms로 체류 시간을 설정합니다. EPI(Enhanced Product Ion Scan)를 사용한 MS² 및 MS³ 실험에서 Q0 트래핑을 사용하여 스캔 속도를 4,000Da/s로 설정합니다. 트랩 채우기 시간을 동적 으로, Q1의 해상도를 단위로 설정합니다. MS³ 실험의 경우, excitation coefficient를 설정하여 단일 전하를 띤 전구체에 대한 monoisotopic peak만 선택되도록 합니다. 여기 시간을 100ms로 설정합니다.

5. MALDI-TOF MS에 의한 과메틸화 글라이칸 분석

1. 과메틸화 Asn-글리칸을 10μL의 50% 메탄올/물(v/v)에 용해시킵니다.
2. 1μL의 용해된 Asn-글라이칸과 2μL의 2,5-디하이드록시벤조산 용액(50% 아세토니트릴/물(v/v) 중 10mg/mL)을 혼합합니다.
3. 1μL의 혼합 샘플을 384웰 MALDI 플레이트에 추가하고 샘플이 완전히 건조될 때까지 기다립니다.
4. 펄스 질소 레이저(337nm)가 장착된 MALDI-TOF 질량 분석기에 플레이트를 삽입합니다. 가속 전압을 양극 모드에서 20kV로 설정합니다.
5. 레이저 출력을 6,000의 임의 스케일로 설정하고 m/z 1,000에서 5,000까지 양의 반사 모드에서 데이터를 획득합니다.

프로나제 E 분해와 과메틸화의 조합에 기초한 방법은 C. jejuni 11168H의 총 단백질 추출물에서 N-글리칸 분석에 적용되었습니다. 그림 1은 실험 절차의 흐름도를 보여줍니다. 일반적인 소화에서 효소와 당단백질의 비율은 1:100에서 1:20 사이로 설정되었습니다. 여기서, 단백질에 대한 Pronase E의 비율을 2 : 1-3 : 1로 증가시키고 더 긴 소화를 사용하여 ...

이 보편적 당체학(universal glycomics) 전략을 구현하기 위한 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 배기 가스 소화를 완료하는 것입니다. 이 방법은 Pronase E 분해 완료에 크게 의존합니다. 따라서 긴 소화 시간과 높은 효소 대 단백질 비율을 사용하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 Pronase E/단백질에 대해 2:1-3:1의 비율과 48시간의 배양 시간을 ?...

저자는 이해 상충이 없습니다.

저자는 Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson, Eleonora Altman에게 도움과 유용한 토론에 감사드립니다.