אסטרטגיית גליקומיקס לא ספציפית מבוססת פרוטאוליזה עבור גליקופרוטאינים חיידקיים

מחקר זה מציג שיטה לניתוח גליקומיקה של גליקופרוטאינים על ידי שילוב של עיכול פרונאז E, פרמתילציה וניתוח ספקטרומטריית מסה. שיטה זו מסוגלת לנתח את כל סוגי הגליקנים המקושרים ל- N, כולל N-גליקנים חיידקיים.

גליקוזילציה של חלבון היא אחד השינויים הנפוצים והמורכבים ביותר לאחר תרגום. פותחו טכניקות רבות לאפיון התפקידים הספציפיים של גליקנים, הקשר בין המבנים שלהם והשפעתם על תפקודי החלבונים. שיטה נפוצה לניתוח גליקנים היא שימוש במחשוף אקסוגליקוזידאז כדי לשחרר גליקנים המקושרים ל-N מגליקופרוטאינים או גליקופפטידים באמצעות פפטיד-N-גליקוזידאז F (PNGase F). עם זאת, הקשרים בין גליקן לחלבון בחיידקים שונים ואין אנזים זמין לשחרור גליקנים מגליקופרוטאינים חיידקיים. בנוסף, גליקנים חופשיים תוארו גם בתאי יונקים, חיידקים, שמרים, צמחים ודגים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה שיכולה לאפיין את מערכת הגליקוזילציה המקושרת ל-N בקמפילובקטר ג'ג'וני על ידי זיהוי גליקנים מקושרים לאספרגין (Asn) וגליקנים חופשיים שאינם מחוברים לחלבוני המטרה שלהם. בשיטה זו, סך החלבונים מ-C. jejuni עוכלו על ידי Pronase E עם יחס אנזים לחלבון גבוה יותר (2:1-3:1) וזמן דגירה ארוך יותר (48-72 שעות). לאחר מכן טוהרו ה-Asn-גליקנים והגליקנים החופשיים שהתקבלו באמצעות מחסניות פחמן גרפיטיות נקבוביות, פרמתילציה ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

חלבון N-גליקוזילציה הוא אחד השינויים הנפוצים והמורכבים ביותר לאחר תרגום באיקריוטים¹. N-גליקנים ממלאים תפקיד חיוני בקיפול חלבונים ויש להם גם השפעה על מיון חלבונים בתעבורה ביוסינתטית². ספקטרומטריית מסה נמצאת בשימוש נרחב בניתוח גליקנים המשתחררים על ידי מחשוף אקסוגליקוזידאז (גליקומיקס). הפפטידים הנותרים נטולי גליקוזיל (גליקופרוטומיקה) שימשו בדרך כלל לזיהוי רצפי הפפטידים הגליקוזיליים באיקריוטים³. הזיהוי של גליקנים המקושרים ל-N בקמפילובקטר ג'ג'וני הצביע על כך ש-N-glycosylation אינו מוגבל לאיקריוטים 4,5,6,7,8.^....

1. תרבית של C. jejuni 11168H ומיצוי סך החלבונים

הערה: C. jejuni 11168H הוא נגזרת משובטת היפרמוטלית של NCTC 11168¹².

1. התחל את תרבית התאים על ידי החזרת נוזל התא (כ-0.15 גרם, NCTC) עם כ-5 מ"ל של מדיום תרבית מולר-הינטון. השתמש בכמה טיפות של צינור המרק הראשוני כדי לחסן צלחת אגר מולר-הינטון. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות תחת אטמוספירה מיקרואירופילית, כלומר 5% O₂, 10% CO₂ ו-85% N₂.
2. קצרו מדשאות חיידקים עם 1 מ"ל של מרק עירוי לב מוח (BHI). מדללים את הקציר כדי להגיע לכ-1 x 10⁵ c....

השיטה המבוססת על השילוב של עיכול פרונאז E ופרמתילציה יושמה על ניתוח N-glycan מתמציות חלבון כוללות של C. jejuni 11168H. איור 1 מציג תרשים זרימה של הליך הניסוי. בעיכול טיפוסי, היחס בין אנזים לגליקופרוטאין נקבע בין 1:100 ל-1:20. כאן, היחס בין פרונאז E לחלבון הוגדל ל-2:1-3:1 ו?.......

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול ליישום אסטרטגיית גליקומיקה אוניברסלית זו. השלב הקריטי הראשון הוא השלמת עיכול הפליטה. שיטה זו תלויה מאוד בהשלמת עיכול Pronase E. לכן חיוני להשתמש בזמן עיכול ארוך וביחס אנזימים לחלבון גבוה. בדרך כלל, מומלץ להשתמש ביחס של 2:1-3:1 עבור פרונאז E/חלבון.......

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

המחברים מודים לקנת צ'אן, דיוויד ג'יי מקנלי, האראלד נוטהאפט, כריסטין מ. שימנסקי, ז'אן-רוברט בריסון ואלאונורה אלטמן על הסיוע והדיונים המועילים.