AIGの病院では、膵管分泌物の減少やpHの低下が膵管細胞の遺伝子発現にどのような影響を与えるのか、特にがん遺伝子に着目して調べ、酸性微小環境への細胞適応の可能性を探っています。ここでの課題は、膵臓腫瘍の不均一性であり、治療と実験的アプローチを複雑にしています。そこで、pHを下げた条件下で膵管細胞のRNAC解析を行ったところ、3つのがん遺伝子の発現が増加していることがわかり、酸性環境と膵管細胞におけるがん遺伝子発現との関連が明らかになりました。
私たちの研究は、pHが低下した条件下でのがん遺伝子の発現に光を当てており、このシステムは、炎症条件下での膵管腺癌の研究を前進させることができます。したがって、この研究の将来の範囲は、慢性膵炎などの炎症条件下での腫瘍の開始におけるがん遺伝子発現の増加の役割を評価することです。まず、ヒトの正常な膵管細胞株を調達します。
細胞を摂氏37度で水浴中で解凍します。次に、新たに調製した完全な培地をシリンジフィルターでろ過します。新しい15ミリリットルの円錐管に6ミリリットルの完全な媒体を追加します。
次に、解凍した細胞懸濁液をチューブに移し、十分に混合します。懸濁液を1,800Gで6分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットに1ミリリットルの培地を加えてから、穏やかに混合します。
次に、4ミリリットルの完全培地を60ミリメートルのペトリ皿に加えます。次に、細胞懸濁液をフラスコに滴下します。5%の二酸化炭素補給の下で、培養物を摂氏37度でインキュベートします。
培地のpHを変更するには、まず、pH値が6.0、6.5、および7.0の0.5モルリン酸ナトリウム緩衝液100ミリリットルを調製します。pHメーターでpHをチェックし、1モルの塩酸または1モルの水酸化ナトリウムを使用して調整します。次に、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して、層流フード内のバッファーをろ過し、滅菌します。
次に、それぞれのpHの滅菌0.5モルリン酸ナトリウム緩衝液20ミリリットルを80ミリリットルの培地に加えて、異なるpHの培地を調製します。pHを変更した培地を85〜90%のコンフルエントなヒト ?? 管細胞に加えます。.明視野顕微鏡で1時間間隔で6時間、形態学的変化を観察します。
培養物からRNAを単離するには、まず培地を吸引し、1ミリリットルのPBSで細胞をすすぎます。60ミリメートルの皿を氷の上に置き、次に60ミリメートルの皿に1ミリリットルのPBSを置き、細胞スクレーパーで細胞をこすり落とします。次に、サスペンションを新しいチューブに移します。
それを8, 000 Gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。次に、β-メルカプトエタノールを含む600マイクロリットルの溶解緩衝液をペレットに加えます。氷上でサスペンションを5〜10分間ピペットで上下させます。
等量の70%エタノールを溶解物に加え、懸濁液をピペットで十分に混合します。溶液をシリカメンブレンカラムに移します。次に、カラムを8, 000 G以上で30秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
次に、500マイクロリットルの洗浄バッファーをサンプルに加え、再度遠心分離します。8, 000 G.Finally以上で1分間空のチューブを遠心分離し、カラムにヌクレアーゼフリー水の30〜50マイクロリットルを追加します。室温で5分間インキュベートした後、カラムを8, 000 Gを超える速度で5分間再度遠心分離します。
酸性培地中の細胞サイズの有意な減少と延性細胞の収縮は、通常の培地で維持された細胞と比較して観察されました。細胞死の最も顕著な変化は、6時間のインキュベーション後に起こり、22時間後には細胞数と細胞ストレスの兆候がさらに減少しました。アップレギュレーションされた遺伝子の数は、pH 6.5で148遺伝子と最も多く、次いでpH 7で109遺伝子、pH 6で90遺伝子でした。
ダウンレギュレーションされた遺伝子は少なく、pH 6では20個、pH 6.5では14個、pH 7では23個でした。LCK、FGR、ASAP 3の3つのがん遺伝子は、試験したすべてのpHレベルでアップレギュレーションされ、酸性条件下での細胞増殖に一役買っていることが示唆されました。
