CAR-T細胞療法は、特定の病理学的がんの治療において前例のない成功を収めています。この研究では、一過性CAR-T細胞を作製するための非ウイルス性長期統合アプローチを導入し、CAR-T細胞の機能を評価するための標的を絞った手順を提供しました。私たちの研究は、より費用対効果の高いアプローチで安全で効果的なCAR-T細胞を作製することを目指しています。
CAR-T細胞は通常、ウイルス形質導入によって生成されます。レトロウイルスとアンチウイルスは、CAR遺伝子導入の最も一般的なウイルスベクターです。ウイルスベクターの製造は複雑で費用がかかり、ウイルス形質導入により、T細胞ゲノムへのCARコードDNAのランダムかつ永続的な組み込みが誘導されるため、安全性の懸念が生じる可能性があります。
私たちのプロトコールは、CARを推移的に発現するだけのCAR T細胞を作製するための非ウイルス性アプローチを提供します。この方法では、CAR発現にmRNAを使用し、エレクトロポレーションを使用してmRNAをT細胞に導入します。これはT細胞ゲノムへの遺伝子統合を伴わず、製造手順がより簡単で費用対効果が高いです。
まず、制限酵素BGL2でCARプラスミドDNAを直鎖化し、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールDNA抽出手順を実行します。直鎖状DNAを精製した後、アガロースゲル電気泳動でテンプレートのサイズと完全性を確認します。in vitro転写の場合は、反応成分を混合し、反応混合物を摂氏37度で少なくとも2時間インキュベートします。
転写後、2マイクロリットルのリボヌクレアーゼIII、DNase Iを反応に加えます。穏やかに混合し、摂氏37度で15分間インキュベートして、テンプレートDNAを分解します。転写したCAR mRNAをRNAクリーンアップキットで精製し、ヌクレアーゼフリー水で希釈します。
mRNA濃度を分光光度計で測定してから、マイナス80°Cで保存します。in vitroで転写および精製したカーmRNAサンプルを氷上で解凍します。1ミリリットルのCAR T培地に凍結保存されたヒト末梢血単核細胞6個の累乗に1回10を懸濁します。
T細胞を活性化するには、同数の洗浄済みヒトT活性化剤CD3/CD28ビーズを添加します。細胞を37°Cで培養し、加湿インキュベーターで5%二酸化炭素で数日間増殖させます。1ウェルあたり1ミリリットルのCAR T培地を12ウェルプレートの2つのウェルに加え、37°Cでインキュベートして平衡化します。
次に、10の5倍を6つのT細胞の累乗で滅菌チューブに移します。CD3/CD28ビーズを取り外すには、チューブを磁気スタンドに置き、細胞懸濁液を新しいチューブに慎重にピペットで移します。チューブを300 Gで室温で5分間遠心分離します。
上清を廃棄した後、細胞ペレットを1ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。チューブを再度遠心分離し、細胞ペレットをネオンバッファーT.Mixの200マイクロリットルのネオンバッファーT.Mixで希釈した5マイクログラムのCAR MNAと100マイクロリットルの細胞を総容量125マイクロリットルで混合します。残りの100マイクロリットルの細胞に25マイクロリットルのネオンバッファーTを添加し、これがネガティブコントロールとして機能します。
ネオンエレクトロポレーションシステムを1、800ボルト、10ミリ秒、および単一のパルスに設定します。ネオンピペットを使用して、T細胞のCAR mRNA混合物をネオン100マイクロリットルのチップに吸引し、細胞をエレクトロポレートします。エレクトロポレーションした細胞を直ちに12ウェルプレート内の平衡化培地に移し、プレートをインキュベーターに戻して、細胞が使用可能になるまで細胞を増殖させます。
エレクトロポレーションの6時間後に、CAR mRNAをトランスフェクションしたT細胞を回収し、フローサイトメトリー解析を行います。CAR-T細胞をピペットで数回混合し、少なくとも1回、5細胞の累乗で10回以上を5ミリリットルの蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブに移します。3ミリリットルのコールドウォッシュバッファーをチューブに加え、チューブを500Gで室温で5分間遠心分離します。
上清を廃棄した後、細胞ペレットを100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。2マイクロリットルの蛍光標識検出抗体と7種類のAAD生存率色素を懸濁細胞に加えます。サンプルを混合し、光への曝露を避けて氷上で30分間インキュベートした後、細胞を3ミリリットルのコールドウォッシュバッファーで洗浄し、チューブを室温で500 Gで再び遠心分離します。
上清を捨てた後、細胞を100マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、すぐにフローサイトメーターを使用して細胞を分析します。細胞表面にCAR抗原を発現する腫瘍細胞から培地を取り除きます。PBSで細胞を洗浄した後、0.05%トリプシンEDTA溶液1ミリリットルで摂氏37度で1分間インキュベートし、次いで適切な培地で10の1〜5倍の密度で単一細胞懸濁液を調製します。
次に、50マイクロリットルの予熱した腫瘍細胞培養培地をEプレートに加え、リアルタイム細胞分析またはRTCA装置に置いてバックグラウンドインピーダンスを測定し、次に100マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液を各ウェルに加え、プレートを室温で30分間平衡化します。EプレートをRTCA装置に戻し、セルインデックスを24時間監視し、5〜15分ごとに測定を行います。翌日、CAR-T細胞懸濁液を調製します。
セルインデックスの記録を一時停止し、RTCA装置からEプレートを取り外します。プレートをわずかに傾け、腫瘍細胞を乱さずに各ウェルから50マイクロリットルの培養培地を慎重に取り出し、次に100マイクロリットルのCAR-T細胞または制御T細胞を各ウェルに追加します。EプレートをRTCA装置に戻し、少なくとも24時間、5〜15分ごとにスイープを行いながら、セルインデックスモニタリングを再開します。
細胞インデックスのモニタリングを停止し、細胞毒性の結果を解析します。サイトカイン分泌分析では、各ウェルから上清を丸底またはV字型の96ウェルプレートに移します。96ウェルプレートを室温で5分間300 Gで遠心分離し、上清を新しい96ウェルプレートに慎重に移します。
最後に、市販のELISAキットを使用して上清中のサイトカインレベルを測定します。CAR mRNA配列は、ゲル電気泳動により約2キロベースのサイズであることが確認されました。活性化T細胞の50%以上がエレクトロポレーション後1日目にCARを発現し、2日目には70%以上に増加し、5日目には約10%に減少しました。
CAR-T細胞は、HER2陽性SK-OV-3腫瘍細胞に対して有意な細胞毒性を示し、腫瘍インピーダンスの急激な減少によって示されましたが、対照T細胞は最小限の効果を示しました。高レベルのインターフェロンガンマ分泌は、CAR T細胞培養培地で検出されましたが、対照群では検出されませんでした。
