Name: in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells at JoVE.com

このプロジェクトは、バーデン·ヴュルテンベルク、ドイツに欧州社会基金によって資金を供給された。

必須のDNAコード配列を含むプラスミドの1増強（CDS） <ol><li>前加温室温への変換キットに含まれているSOC培地中、37℃で、100μg/ mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート。 42℃に水浴を平衡化する。 </li><li>化学的に部品Eの1バイアルを解凍氷上で大腸菌 。 </li><li>化学的に部品Eのバイアルに、CDSを含むプラスミドの1-5液（100 ngのには10pg）を追加大腸菌とは穏やかに混合。ピペッティングにより細胞を混在させないでください。プラスミドを追加した後、静かにチューブをタップして混ぜる。 </li><li>氷上で30分間混合物をインキュベートする。 </li><li>熱ショックE.振盪せずに水浴中で42℃で30秒間大腸菌 。 </li><li> 2分間氷上にバイアルを置きます。 </li><li> Eに予め温めSOC培地250μlを添加するcoliおよび細菌インキュベーター中で37℃で1時間、300rpmで水平に細菌を振る。 </li><li><html> 、予め温めたLB寒天プレート上に形質転換混合物からの100μlの150μLを広げ、プレートを反転させ、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>コロニーが見えるようにした後、100μg/ mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地を含む15ml容の培養チューブに各プレートからの単一コロニーを接種する。文化が遅れてログまたは定常期になるまで、300 rpmで振盪しながら37℃で一晩、それらをインキュベートする。 </li><li>形質転換されたE.の長期保存のためにコリ、ピペットクライオバイアルへの100％のグリセロール75μlの。細菌培養（冷凍ストックは25％グリセロールを含有するであろう）の225μl加え、よく混ぜ、-80℃で凍結バイアルを格納します。 </li><li>製造元の説明書に従って、プラスミド精製キットを使用して必要なCDSを含むプラスミドを単離する。 </li><li>分光光度計を用いてプラスミド濃度を決定する。 </li><li> 20μlの一定分量を準備し、長時間-20℃で保管してください。 </li></ol>_title &quot;&gt; 2。プラスミドインサートの増幅およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ポリTテールを追加する<ol><li> NOTE：in vitro転写 （IVT）用のDNA鋳型を得るために、関心のCDSは、ここでeGFPを、PCRを用いて増幅される。同時に、120チミジン（T）のポリTテールはT 120拡張子を持つリバースプライマーを用いてインサートに加えられる。これにより、生成されたmRNAは、IVTの後に定義された長さを持つポリAテールを得る。 </li><li> 表1に詳述するようにPCR混合物を準備します。 </li><li>徹底的に反応ミックスを混ぜる。注：PCR産物が4-5 IVT反応に使用することができる。 IVTのためのDNAテンプレートの量を増加させるために、PCR混合物の全体積を増加させることができる。いくつかのPCRチューブはそれぞれ含む100μlのPCR混合物をPCR産物の十分な収量を得るために使用することができる。 </li><li>サーモPCRチューブを配置し、PCRサイクリング·プロトコル（ 表2）を用いたPCRを実行します。 </li><li> Pは、クリ​​ーンアップCR反応は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを使用し、20μlのヌクレアーゼフリー水を用いてDNAを溶出する。 </li><li>分光光度計を用いてDNAの濃度を測定する。注記：検出されたDNAの濃度は、約300μgの/ mlである。このように、予想される合計金額は、〜6μgのでなければなりません。他のタンパク質のためのDNAの量は、CDS、PCR、プライマーのアニーリング温度のために使用されるプラスミドの量は、サイクル数の長さに応じて異なり得る。 </li><li>長い間、-20℃でDNAを凍結またはIVTのためにそれを直接使用しています。 </li></ol> 3.コントロールステップ：PCR産物の品質<ol><li> DNAゲル電気泳動によってPCR産物の品質を確認する。 </li><li>フラスコ内の1x TBEアガロース所望の量を混ぜる。 1％アガロースゲルは、1×TBE 50mlにアガロースを0.5g加える。 </li><li>アガロースまでマイクロ波が溶解する。それは沸騰させないでください。アガロースが完全に溶液中にあることを確認してください。 </li><li> 50ミリリットルのアガロースゲルに5μlの核酸ゲル染色を追加します。 </li><li>アガロースゲルボックスにゲルを注ぎ、コームを設定し、ゲルが固化するまで約1時間待ち。 </li><li>コー​​ムを取り外し、ゲルトレイにゲルボックスを配置します。 </li><li> 12μlの総容量2μlの6Xローディングバッファーと80-10,000 bpのDNA-ラダー2μlの（200 ng）をPCR産物200ngの各を混ぜる。 </li><li>慎重にアガロースゲルのウェルにDNAサンプルをロードします。 </li><li>ランニングバッファーとして1×TBEを使用して、1時間、100Vでアガロースゲルを実行します。 </li><li>画像化システム（ 図2）上のDNAのバンドを可視化。 </li></ol> 4. in vitro転写 （IVT） <ol><li>注：PCRの後、プラスミドインサートを増幅されたポリTテールが付加される。 IVTの間に、遺伝情報はDNAからRNAに転写される。生成されたmRNA転写物は、細胞内でタンパク質を産生するために使用される。 </li><li>アーゼdで作業領域とピペットをきれいにecontaminationソリューション。使用のRNaseと混合反応の汚染を最小限に抑えるために手袋を変更し、PCRクリーンで滅菌デュアルフィルターピペットチップと頻繁に。 </li><li> 表3に記載したように、NTP /キャップアナログ混合物を準備します。 </li><li>ボルテックスで徹底的にNTP /キャップアナログの混合物を混合し、手短にスピンダウン。 </li><li> 表4に記載するようにIVT反応混合物を組み立てる。 </li><li>優しくピペッティングにより完全にIVT反応混合物を混ぜる。次に、チューブの底に混合物を収集するために簡単にPCRチューブを遠心する。 </li><li>サーモで3時間、37℃でインキュベートする。 注：最適なインキュベーション時間は、指定されたテンプレートの挿入や転写効率の長さに依存する。短いインサート（&lt;500塩基）については、より長いインキュベーション時間は、有利であり得る。時間経過実験は、最大収率のための最適なインキュベーション時間を決定するために行うことができる。したがって、examplため、IVT反応をセットアップする電子、1、2、3、4、6時間、および一晩のインキュベーションのためにおよびmRNAの量を決定する。 eGFPのmRNAの生成のためのインビトロ転写の動態は、 図3に示されている。 </li><li> 、テンプレートDNAを除去IVT反応混合物にDNアーゼを1μl（2U /μl）を追加するには、よく混ぜ、37℃で15分間インキュベートする。 </li><li> manufacturer&#39;s指示に従ってRNA精製キットを用いて反応混合物を精製する。 40μlのヌクレアーゼフリー水で二回スピンカラム膜から修正されたmRNAを溶出する。注記：検出RNA濃度は約1,500μg/ mlのである。このように、予想される総量は〜120μgのでなければなりません。他のタンパク質のために合成されたmRNAの量は、CDSの長さとIVTに使用されるPCR産物の量に応じて異なることができる。 </li></ol>南極ホスファターゼで精製mRNAの5。治療<ol><li>注：生成されたmRNAは、5 &#39;トリ除去するホスファターゼで処理さ免疫活性化にRIG-Iによって認識され、リードすることができるリン酸塩、。さらに、ホスファターゼ処理は、セルフライゲーション反応で再環状化を防止する。 </li><li>精製mRNA溶液を79μlに10倍南極ホスファターゼ反応バッファーの9を添加する。その後、南極ホスファターゼ（5U /μl）を2μlのを追加して、静かにサンプルを混ぜる。 30分間37℃で反応混合物をインキュベートする。 </li><li> manufacturer&#39;s指示に従ってRNA精製キットを用いて反応混合物を精製する。 50μlのヌクレアーゼフリー水で二回スピンカラム膜から修正されたmRNAを溶出する。 </li><li>分光光度計を使用して修正するmRNAの濃度を測定する。チェックを260nm / 280nmでの吸光度の比（280分の260）が ≥1.8と260の比率/ 230は純度を示し、これ2.0であること。 注：予想される総収量はsufficie約90μgの、あるべきNT約36 mRNAのトランスフェクションのために。 </li><li>ヌクレアーゼフリー水を添加して100 ng /μLでのmRNAの濃度を調整します。 </li><li> -80℃でのトランスフェクションや店舗に必要な使い捨てのアリコートに変更されたmRNAを分注し。複数の凍結融解サイクルを避ける。適切に準備し、mRNAは、長年にわたって安定して保存され。作業中は、常に氷上に変更されたmRNAを保つ。 </li></ol> 6.コントロールステップ：合成修正mRNAの品質<ol><li> RNAゲル電気泳動によって変更されたmRNAの品質を確認してください。 </li><li>フラスコ内の1x TBEアガロース所望の量を混ぜる。 1％アガロースゲルは、1×TBE 50mlにアガロースを0.5g加える。 </li><li>アガロースまでマイクロ波が溶解する。それは沸騰させないでください。アガロースが完全に溶液中にあることを確認してください。 </li><li> 50ミリリットルのアガロースゲルに5μlの核酸ゲル染色を追加します。 </li><li>アガロースゲルボックスにゲルを注ぎ、コームを設定し、ゲルがソリになるまで約1時間を待つdified。 </li><li>コー​​ムを取り外し、ゲルトレイにゲルボックスを配置します。 </li><li> 0.5〜10キロバイトセンスRNAラダーと10μlの総体積で7μlのローディングバッファーを用いて合成されたmRNA修正200ngの各3μlの（3μgの）を混ぜる。ローディング緩衝液の組成を表5に記載されている。 </li><li> 70℃で10分間ラダーおよびmRNA試料を変性。 </li><li>丁寧に1％アガロースゲル上でラダーとmRNAサンプルをロードします。 </li><li>ランニングバッファーとして1×TBEを使用して1時間、100Vで電気泳動を行います。 </li><li>ゲルドキュメンテーションシステム（ 図4）を使用して、UVトランスイルミネーターと写真にはしごやmRNAのバンドを可視化。 </li></ol> 7.トランスフェクションのための細胞の準備<ol><li> 12ウェルプレートのウェル当たりプレート2×10 5細胞（HEK293細胞）。 </li><li>細胞インキュベーター中で37℃で一晩細胞をインキュベートする。注：トランスフェクションの日に、細胞は、REACを持つべき80〜90％のコンフルエンスにHED。 </li></ol>細胞のmRNAのトランスフェクションの実行8. <ol><li>修正されたmRNAを解凍する。 </li><li>トランスフェクションのためのリポプレックスを生成します。 </li><li>修正されたmRNAの25μlの（2.5μgの）を追加し、473μlののOpti-MEM（最小必須培地）へのカチオン性脂質トランスフェクション試薬2μlの私は12ウェルプレートの1ウェルのトランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を生成するために、血清培地を減少させた。トランスフェクトされる井戸の数に応じてボリュームをスケールアップ。陰性対照として、mRNAをすることなく、トランスフェクション混合物を準備します。 </li><li>ピペッティングにより穏やかに成分を混合。トランスフェクションのためのリポプレックスを生成するために20分間室温でトランスフェクション混合物をインキュベートする。 注：トランスフェクション混合物には抗生物質が含まれていません。このように、細胞の処理中に無菌性を確保するために注意してください。 </li><li> /ウェル500μlのDPBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 12ウェルPLAの1つのウェルに500μlのトランスフェクション混合物を追加します。TE。 </li><li> 37℃で4時間、細胞をインキュベートし、5％CO 2。 </li><li>トランスフェクション混合物を吸引し、細胞を1ミリリットルの完全な細胞培養培地を加える。 </li><li>細胞インキュベーター中で24時間細胞をインキュベートする。 </li><li>蛍光顕微鏡を実行すると、蛍光顕微鏡（ 図5）を使用して分析します。注：eGFPの他のmRNAは、mRNAをコードするトランスフェクションによって産生される細胞中の他のタンパク質の発現を調べるために、細胞をカバーガラス上で培養することができる。次いで、トランスフェクションを行うことができ、細胞を適切な抗体で染色し、蛍光顕微鏡によって分析することができる。 </li></ol>細胞におけるEGFP発現9.フローサイトメトリー解析<ol><li>井戸からの細胞培養培地を除去し、1mlのDPBS（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で各ウェルを洗う。細胞培養プレートの表面から細胞を剥離するために、ウェル当たり500μlのトリプシン/ EDTAを追加します。その後、500を追加トリプシンを不活性化するウェルあたりμlのTNS。 </li><li>室温で300×gで5分間分離した細胞を遠心します。唯一のペレットを残して上清を取り除きます。 150μlの細胞固定液中に細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> eGFPを発現する細胞の割合およびジオ平均（蛍光強度の幾何平均）（ 図6）を用いて蛍光強度を分析する。 </li></ol>タンパク質発現の10測定時間オーバー<ol><li>更に、ステップ8で説明したように、12ウェルプレートの3ウェル中の細胞のmRNAのトランスフェクションを行うのmRNAを添加せずに、トランスフェクション混合物を有するHEK293細胞の3つのウェルをインキュベートする。 </li><li> eGFPの1,2の発現を測定し、トランスフェクションの3日後、タンパク質発現（ 図7）の持続時間を評価する。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

mRNAの治療は、再生医療の分野では、疾患及びワクチン接種の治療において大きな可能性を有している。このビデオでは、細胞におけるタンパク質発現の誘導のための安定化された、修飾されたmRNAの産生を実証する。このプロトコルを使用して、他の所望のmRNAを生成することができる。修飾されたmRNAのインビトロ合成は、所望のmRNAの細胞のトランスフェクションは、標的タンパク質の発現を誘導することができる。外的にデリバリーmRNAが完全に分解されるまで、それによって、所望のタンパク質は、生理的条件下で一過的に発現されている。 このビデオでは、eGFPの発現は、eGFPのmRNAとHEK293細胞の単一トランスフェクション後3日間、示された。他のタンパク質をコードするmRNA分子は、短いタンパク質発現期間につながる可能性がある。タンパク質の発現は、外因的に送達されたmRNAの分解を減少させる。 SOMのためのこの技術のため、制限電子メールアプリケーションは、タンパク質発現の一過性誘導かもしれない。したがって、より長い期間、細胞中のタンパク質発現を維持するために、mRNAの再配達が要求される。 mRNAのトランスフェクションは、挿入変異誘発およびウイルスベクターと比較して、癌および白血病の発症を予防する宿主ゲノム中への非統合の利点を有するが、 インビボでのトランスフェクション効率は、ウイルスベクターを使用するよりも少ない可能性がある。 トランスフェクション試薬を必要とするmRNA濃度および量が不足しているタンパク質を産生するmRNAの外因性送達のための標的細胞はそれぞれ異なる細胞型14に最適化されるべきである。 mRNAの凍結融解の繰り返しは、産生されたmRNAの安定性を維持するために避けるべきである。したがって、作業アリコートを調製することができる。 PCR及びIVT後、単一の特異的なバンドが検出されるべきである。そうでない場合は、PCRサイクル数は、プライマーanneaリング温度、および/またはプラスミドDNAの量は、IVTのために特定のDNA生成物を得るために最適化されるべきである。また、IVT用IVT時間およびDNAテンプレートの量が十分な量の特定の長さのmRNAを得るために最適化することができる。

細胞では、メッセンジャーRNAの転写（mRNA）のおよび所望のタンパク質へのmRNAの翻訳は以下の細胞の適切な機能を確保する。遺伝性または後天性の遺伝性疾患は、タンパク質の不十分や機能不全の合成につながり、深刻な病気を引き起こす可能性があります。したがって、存在しないか、または欠陥のあるタンパク質の産生を誘導するための新しい治療的アプローチは、所望のタンパク質をコードする細胞への合成修飾されたmRNAの外因性送達である。これにより、細胞は、それらが正常に作り出すことができない、または天然必要はありません機能性タンパク質を合成するためにトリガされます。このアプローチを用いて、遺伝的障害は、欠陥または欠落タンパク質1をコードするmRNAを導入することによって補正することができる。 mRNAの療法は、腫瘍細胞または病原体により発現されるタンパク質抗原を、synthetizeするワクチン接種のために使用することができる。それによって、宿主免疫系を効果的に腫瘍細胞を排除またはinfeを防止するために活性化することができるctions 2,3。また、近年では、mRNAは、正常に誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）を作製した。この目的のために、線維芽細胞は、再プログラミングの発現が4~6因子誘導し、再生医療において大きな可能性を有するiPS細胞でそれらを変換するためにmRNAをトランスフェクトした。 以前は、従来のmRNAの使用は、低い安定性および強力な免疫原性と関連していた。このように、従来のmRNAの臨床応用は限られていた。しかし、Karikoと同僚によるmRNA分子内の5-メチルシチジン及びシュードウリジンによるシチジンおよびウリジンの置換は、生物学的液体中の安定したmRNA分子をレンダリングし、劇的に今修正されたmRNAの臨床適用性を可能にする免疫活性化7-10、減少した。 合成的に生成された変更されたmRNAを用いて、所望の遺伝子の転写物は、一時的に、生体内 11 で送達することができるまたはインビトロでタンパク質発現を誘導した。導入されたmRNAは細胞翻訳機構によって、生理的条件下で翻訳される。によるウイルス遺伝子治療ベクターと比較して、宿主細胞ゲノムへの組込みの欠如のために、腫瘍形成のリスクが12,13を防止することができる。このようにして、変性合成mRNAを用いた治療は、将来の良好な臨床受け入れを取得します。 ここでは、変更されたmRNA（ 図1）、mRNAおよびトランスフェクトされた細胞におけるタンパク質発現の評価を用いた細胞のトランスフェクションを製造するための詳細なプロトコールを記載する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium&amp;nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&amp;nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td></tr><tr><td>HEK-293 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, 12-well&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask (75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml conical tubes&amp;nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 &amp;micro;l: 022491202; 100 &amp;micro;l: 022491237; 1,000 &amp;micro;l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Plasmid amplification and purification&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>Dissolve 25 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>LB agar (Luria/Miller)&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>Dissolve 40 g L&lt;sup&gt;-1 &lt;/sup&gt;in sterile water.</td></tr><tr><td>Ampicillin Ready Made Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;mRNA production&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>Pseudouridine-5&amp;acute;-triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&amp;acute;-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;acute;)ppp(5&amp;acute;)G RNA cap structure analog&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&amp;micro;l&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&amp;micro;l (from MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Antarctic phosphatase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap solution&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Cationic lipid transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Media&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Gel electrophoresis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10,000x in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flow cytometry analyses&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x concentrate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;-TTGGACCCTCGTAC&lt;br /&gt;AGAAGCTAATACG-3&amp;acute;</td></tr><tr><td>Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &amp;micro;M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&amp;acute;- T&lt;sub&gt;120&lt;/sub&gt;-CTTCCTACT&lt;br /&gt;CAGGCTTTATTCAA&lt;br /&gt;AGACCA-3&amp;acute;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cell incubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (5%) and O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (20%)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CASY cell counter&amp;nbsp;</td><td>Sch&amp;auml;rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile workbench&amp;nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial incubator&amp;nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Analytic Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus for electrophoresis&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel documentation system&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan System&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phase-contrast microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

所望の細胞におけるタンパク質合成を誘導するための合成メッセンジャーRNA（mRNA）をコードする外因性送達は、再生医療、基本的な細胞生物学、疾患の治療、および細胞の再プログラミングの分野で大きな可能性を有している。ここでは、フローサイトメトリーにより誘導されるタンパク質の発現の減少した免疫活性化の可能性と安定性の増加、産生されたmRNAの品質管理、細胞のトランスフェクションされたmRNAと、検証と修正されたmRNAの生成のためのステップバイステップのプロトコルを記述する。 eGFPのmRNAを持つ単一のトランスフェクション後3日までに、トランスフェクトHEK293細胞のeGFPを生産。このビデオの記事では、eGFPのmRNAの合成を例に挙げて説明する。しかし、この手順は、他の所望のmRNAの産生に適用することができる。 mRNAを変性合成を使用して、細胞が一過性に、彼らは通常は発現しないと所望のタンパク質を発現するように誘導することができる。

eGFPのCDSを含むのpcDNA 3.3プラスミドを用いて、修正されたeGFPのmRNAの合成（ 図1）が設立された。 PCRによるインサートの増幅およびポリT-テーリングの後、約1100塩基対の長さの明確なバンド（ 図2）が検出される。 IVT時間を増加させると、mRNAの収率（ 図3）を増補。 IVTの後、約1100塩基対の長さを有する透明なmRNAのバンドが製造されるのeGFP mRNAの長さ（ 図4）に対応する検出された。 生成されたeGFP mRNAの機能は、HEK293細胞のトランスフェクションによって試験した。この目的のために、トランスフェクション複合体（リポプレックス）は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して生成された。トランスフェクションは、12ウェルプレートのウェルあたり2×10 5個の細胞を用いて行った。細胞におけるeGFPの製造はFigu（蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクションの24時間後に検出された5 Re）とします（ 図6）フローサイトメトリー。 HEK293細胞は、eGFPのmRNAをトランスフェクトした。 eGFP発現は、1,2、および3日間トランスフェクション細胞でのタンパク質発現の持続時間を評価する（ 図7）後に決定した。 24時間後、タンパク質発現は、細胞内で最も高かった。量は、すべての次の日1.6倍に減少した。でも、3日後、細胞をeGFPを含有していた。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：既知のフランキング配列を有する修飾されたmRNAの製造工程の概要コードDNA配列（CDS）は、特異的プライマーを用いたPCRにより増幅される。 PCR産物を精製し、生成されたDNAの品質が決定される。 mRNAは、in vitro転写プロセスを用いてDNA産物から生成される。製品はpurifieです<html> dおよび5&#39;-三リン酸を除去するホスファターゼで処理した。生成されたmRNAのさらなる精製および品質管理の後、mRNAのトランスフェクションを行うことができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig2highres.jpg" width="500" /> 図2：PCR後の DNAラダーとPCR産物のDNA生成物の分析は、1％アガロースゲル上で泳動した。約1100塩基対の長さを有する透明なDNAバンドが検出されるはずである。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig3highres.jpg" width="500" /> 図3のeGFP mRNAの生成のためのインビトロ転写の動態 2後1）RNAラダーとIVT生成物）0分、3）10分間、4）30分、5）180分、6）、360分、および7）。単独のDNA鋳型を、1％アガロースゲル上で泳動した。 常に &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページFO」ve_content <img alt="図4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig4highres.jpg" width="400" /> 図4：IVT RNAラダーとIVT産物後のmRNA産物の分析は、1％アガロースゲル上で泳動した。約1100塩基対の長さを有する透明なmRNAのバンドが検出されるはずである。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig5highres.jpg" width="500" /> 図5：HEK293細胞のeGFP mRNAのトランスフェクション24時間後の蛍光顕微鏡分析。 100Xの倍率での細胞の（A）位相コントラスト画像（B）100倍の倍率での細胞の蛍光画像。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig6highres.jpg" width="500" /> フィギュア6：フローサイトメトリーは、HEK293細胞におけるEGFP発現のeGFPのmRNAのトランスフェクションの24時間後に分析し、ピンクの線は、mRNAトランスフェクションなしで細胞を表し、青い線がeGFPのmRNAのトランスフェクションの後にEGFP陽性細胞を表している。 eGFPのmRNAのトランスフェクションの後、すべての測定された細胞の93.91パーセントは正であり、ジオ平均（蛍光強度の幾何平均）は720.16である。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51943/51943fig7highres.jpg" width="500" /> 図7：フローサイトメトリーは、1,2、および3日のeGFP mRNAのトランスフェクション後のHEK293細胞におけるeGFP発現の分析 、タンパク質発現は、mRNAのトランスフェクション後に最高24時間である。その後、量は毎日1.6倍減少した（n = 3）。 表1：PCR混合物の組成物。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing=&quot;0&quot;幅= &quot;482&quot;&gt; <tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 最終濃度 </td><td> 量（μL） </td></tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 0.7μM </td><td> 7 </td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td> 0.7μM </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 5倍Q-ソリューション</td><td> 1X </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 5倍のHotStar HiFidelityのPCRバッファー</td><td> 1X </td><td> 20 </td></tr><tr><td>プラスミドDNA </td><td> 50 ngの/100μlの</td><td>変数</td></tr><tr><td>のHotStar HiFidelity DNAポリメラーゼ（2.5 U /μL） </td><td> 2.5 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td></td><td>変数</td></tr><tr><td>全容積</td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> 表1：PCR混合物の組成物。 <table border=「0」CELLPADDING = &quot;0&quot; CELLSPACING = &quot;0&quot;幅= &quot;449&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td> サイクル数 </td><td> 時間 </td><td> 温度（°C） </td></tr><tr><td>最初の変性工程</td><td> 1 </td><td> 5分</td><td> 95 </td></tr><tr><td> 3ステップサイクリング</td><td rowspan="4" style="vertical-align:middle; text-align:center;"> 2-25 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ·変性</td><td> 45秒</td><td> 95 </td></tr><tr><td> ·アニーリング</td><td> 1分</td><td> 55 </td></tr><tr><td> ·エクステンション</td><td> 1分</td><td> 72 </td></tr><tr><td>最終伸長工程</td><td> 26 </td><td> 10分</td><td> 72 </td></tr><tr><td> PCRサイクルの終わり</td><td></td><td>不定</td><td> 4 </td></tr></tbody></table> 表2：PCRサイクリング広報otocol。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ストック濃度（mM）を </td><td> 最終濃度（MM） </td><td> 容量（μL） </td></tr><tr><td> ATP（のMEGAscript T7キットから） </td><td> 75 </td><td> 7.5 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP（のMEGAscript T7キットから） </td><td> 75 </td><td> 1.875 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> （トライリンクから）私-CTP </td><td> 100 </td><td> 7.5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> （トライリンクから）、擬似UTP </td><td> 100 </td><td> 7.5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 3&#39;-O-Meの-M 7 G（5 &#39;）pppは（5&#39;）G RNAキャップ構造アナログ</td><td> 10 </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>全容積</td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table>表3：NTP /キャップアナログ混合物の組成物。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 最終濃度 </td><td> 量（μL） </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td></td><td>変数</td></tr><tr><td> RNアーゼ阻害剤</td><td> 40 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NTP /キャップアナログ混合物（ステップ4.3から） </td><td></td><td> 23 </td></tr><tr><td> PCR産物</td><td> 1μgの</td><td>変数</td></tr><tr><td> 10倍反応バッファー</td><td> 1X </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10×T7 RNAポリメラーゼ酵素ミックス</td><td> 1X </td><td> 4 </td></tr><tr><td>全容積</td><td></td><td> 40 </td></tr></tbody></table> 表4：in vitro転写の組成物（IVT）を反応混合物。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="424"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 量（μL） </td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td> 3.3 </td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド</td><td> 1 </td></tr><tr><td> MENバッファー（10倍） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> （peqGOLDレンジミックスのDNAラダーに付属）の6×ローディングバッファー</td><td> 1.7 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 7 </td></tr></tbody></table> 表5：RNAゲル電気泳動用のローディングバッファーの調製。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538"><tbody><tr><td></td><td> 細胞培養培地及びバッファー </td></tr><tr><td> HEK-293細胞培養培地</td><td> FCSの25ミリリットル、ペニシリン/ストレプトマイシンの2.5ミリリットル、L-Gluの2.5mlのを追加します。220ミリリットルDMEM高グルコース中tami​​ne。 4℃でメディアを保管し、2週間以内にそれを使用します。 </td></tr><tr><td> TBE緩衝液（10倍） </td><td> 0.9 M Tris塩基、0.9 Mホウ酸と1 Lの水に20mMのEDTA（Ampuwa）を溶解する。緩衝液のpHは8である。 </td></tr><tr><td> MENバッファー（10倍） </td><td> 200mMのMOPS、50mMのNaOAcを、1 Lの水に10mMのEDTA（Ampuwa）を溶解する。 7にNaOHでpH値を調整します。 </td></tr></tbody></table> 表6：細胞培養培地および緩衝液。

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In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

このビデオの記事では、細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNA のインビトロ合成を記載する。

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.9K ビュー.  University Hospital Tuebingen. このビデオの記事では、細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNA のインビトロ合成を記載する。 

ビデオ: In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

遺伝学

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

発生生物学

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic applications, including a novel class of vaccines, protein replacement therapies, and immune therapies. Among delivery vectors, lipid nanoparticles are found to be safer and more effective in delivering RNA molecules (e.g., siRNA, miRNA, mRNA) and a few products are already in clinical use. To demonstrate lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery, we present an optimized protocol for the synthesis of functional me1&#936;-UTP modified eGFP mRNA, the preparation of cationic liposomes, the electrostatic complex formation of mRNA with cationic liposomes, and the evaluation of transfection efficiencies in mammalian cells. The results demonstrate that these modifications efficiently improved the stability of mRNA when delivered with cationic liposomes and increased the eGFP mRNA translation efficiency and stability in mammalian cells. This protocol can be used to synthesize the desired mRNA and transfect with cationic liposomes for target gene expression in mammalian cells.

The protocol presents in vitro transcription (IVT) of chemically modified mRNA, cationic liposome preparation, and functional analysis of liposome enabled mRNA transfections in mammalian cells.

In recent years, chemically modified messenger RNA (mRNA) has emerged as a potent nucleic acid molecule for developing a wide range of therapeutic ...

生化学

<meta charset="utf8"></head><body>マイクロコンパートメント化合成細胞のためのCFPSプロトコル

Cell-Free Protein Synthesis System for Building Synthetic Cells

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for the core machinery of the Central Dogma, standing as an optimal chassis for the integration and assembly of diverse artificial cellular mimicry systems. Despite its frequent use in the fabrication of synthetic cells, establishing a tailored and robust CFPS system for a specific application remains a nontrivial challenge. In this methods paper, we present a comprehensive protocol for the CFPS system, routinely employed in constructing synthetic cells. This protocol encompasses key stages in the preparation of the CFPS system, including the cell extract, template preparation, and routine expression optimization utilizing a fluorescent reporter protein. Additionally, we show representative results by encapsulating the CFPS system within various micro-compartments, such as monolayer droplets, double-emulsion vesicles, and chambers situated atop supported lipid bilayers. Finally, we elucidate the critical steps and conditions necessary for the successful assembly of these CFPS systems in distinct environments. We expect that our approach will facilitate the establishment of good working practices among various laboratories within the continuously expanding synthetic cell community, thereby accelerating progress in the field of synthetic cell development.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:合成細胞構築のためのCFPSシステムの最適化

This protocol describes the Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system used in constructing synthetic cells. It outlines key stages with representative results in different micro-compartments. The protocol aims to establish best practices for diverse laboratories in the synthetic cell community, advancing progress in synthetic cell development.

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

The Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) system has been widely employed to facilitate the bottom-up assembly of synthetic cells. It serves as the host for ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

生物工学

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

生物学

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

免疫・感染学

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. Efficient and safe delivery systems must be included in the mRNA vaccines due to the fragile properties of mRNA. A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) gene delivery system is specifically designed for the pulmonary delivery of nucleic acids and displays promising capabilities in mediating successful mRNA transfection. Here, an improved method for preparing PP-sNp is described to elaborate on how the PP-sNp&#160;encapsulates Metridia luciferase (MetLuc) mRNA and successfully transfects cultured cells. MetLuc-mRNA is obtained by an in vitro transcription process from a linear DNA template. A PP-sNp&#160;is produced by mixing synthetic peptide/poloxamine with mRNA solution using a microfluidic mixer, allowing for the self-assembly of PP-sNp. The charge of PP-sNp&#160;is subsequently evaluated by measuring the zeta potential. Meanwhile, the polydispersity and hydrodynamic size of PP-sNp&#160;nanoparticles are measured using dynamic light scattering. The mRNA/PP-sNp nanoparticles are transfected into cultured cells, and supernatants from the cell culture are assayed for luciferase activity. The representative results demonstrate their capacity for in vitro transfection. This protocol may shed light on developing next-generation mRNA vaccine delivery systems.

Efficient Transfection of In vitro Transcribed mRNA in Cultured Cells Using Peptide-Poloxamine Nanoparticles

A self-assembled peptide-poloxamine nanoparticle (PP-sNp) is developed using a microfluidic mixing device to encapsulate and deliver in vitro transcribed messenger RNA. The described mRNA/PP-sNp could efficiently transfect cultured cells in vitro.

ペプチドポロキサミンナノ粒子を用いた培養細胞における in vitro 転写mRNAの効率的なトランスフェクション

In vitro transcribed messenger RNA (mRNA) vaccines have displayed enormous potential in fighting against the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. ...

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

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セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

Using Lipid Nanoparticles for the Delivery of Chemically Modified mRNA into Mammalian Cells

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

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