世界保健機関(WHO)は、この地球上の4人に1人が蠕虫と呼ばれる寄生虫に感染していると推定しています。私たちは、蠕虫に対する防御免疫応答がどのように開始され、制御され、実行されるかを理解することを目指しています。蠕虫は、哺乳類の宿主内で何十年も生存し、強い免疫反応に直面した場合でも、少なくとも繁殖するのに十分な期間生存します。
私たちは今、これらの寄生虫がどのように宿主の免疫応答を操作、回避、抑制して生存を延ばすかを理解し始めています。Strongyloides Ratti感染の研究における課題は、この寄生虫が特に移動することであり、これは主に組織を通じて頭部や腸に流れ込むことです。頭と腸で移動する幼虫を定量化することで、さまざまな部位でさまざまな免疫エフェクターを解剖できます。
私たちのグループは、肥満細胞と基底野は組織遊走には完全に不要ですが、腸からのS.rattiの排出には必須であることを確立しました。対照的に、中性野は腸管免疫に重要な役割を果たしていませんが、組織内で移動する幼虫を殺すのに不可欠です。S.ratti感染の性差を研究している間、オスマウスとメスマウスの両方の組織に同じ数の移動する幼虫がいることがわかりました。
しかし、オスマウスの腸内寄生虫数はメスマウスに比べて多いことがわかりました。これは、腸管免疫が生物学的性別によって異なることを示唆しています。まず、ベアマン装置を準備します。
クランプを使用して、ホースの底を斜めに閉じ、ふるいが水没するまで装置にぬるま湯を入れます。ふるいにティッシュワイプを置き、糞便の木炭混合物で満たします。次に、ベアマン装置のすぐ後ろに配置されたライトをオンにし、生存可能なiL3がワイプを介してアクティブに移動するようにします。
30分後、クランプを短く開いて、沈殿した幼虫を50ミリリットルのチューブに集め、容量をできるだけ最小限にします。次に、50ミリリットルのチューブに1%ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSを入れます。幼虫を重力によって摂氏4度のチューブの底に30分間落ち着かせてから、上清を取り除きます。
3回目の洗浄後、ペレットのサイズに応じて、30〜50ミリリットルのPBSペニシリンストレプトマイシンにペレットを再懸濁します。ピペッティングの直前に、iL3幼虫が素早く落ち着くように溶液を攪拌し、溶液の1マイクロリットル滴を顕微鏡スライドに移します。倒立顕微鏡で液滴を40倍の倍率で観察します。
iL3の幼虫が鮮やかに動いていることを確認してください。まず、Baermann装置を使用して、1%ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSで1000または2000のiL3幼虫を準備します。iL3幼虫が重力によって落ち着いたら、0.5ミリリットルの注射器を使用して上清をできるだけ完全に吸引し、チューブ内に約30マイクロリットルを残します。
チューブをフリックするか、0.5ミリリットルのシリンジを使用してiL3懸濁液を再懸濁し、残りの懸濁液をシリンジに吸引します。次に、マウスの首筋をつかみ、片方の後ろ足を固定します。皮下では、iL3幼虫を含む溶液全体をフラットな角度でフットパッドに注入し、シリンジをゆっくりと引っ込めます。.
安楽死させられた感染したマウスの腹部と首に市販の消毒剤をスプレーします。ハサミを使って腹部の皮膚を切り、後ろに引っ張って前腹壁を露出させます。腹腔を開いた後、横隔膜を切断し、リブを両側に開いて胸膜腔内の肺を露出させます。
次に、肺葉を約4ミリメートルで描かれたまたは印刷された線でマークされた24ウェルプレートに収集し、ウェルごとに1ミリリットルの水道水で満たされます。次に、肺全体を約0.75センチメートル×0.75センチメートルの6つに切ります。マウスの頭部を切り落とした後、指で皮膚と被毛を取り除き、筋肉組織の除去を最小限に抑えます。
目の後ろを切り、頭の中心を縦方向に切り取って、頭全体を4つに切り分けます。前部と後部の象限を、2ミリリットルの水道水が入った6ウェルプレートに入れます。インキュベーション後、プレートを最後にもう一度渦巻き、鉗子を使用して残りの組織部分をウェルから取り出し、それらを廃棄します。
井戸内のすべての幼虫を40倍倒立顕微鏡で数えます。ウェル底の線をたどって、完全なカウントを確保します。市販の消毒液に腹部を浸した後、腹部の上の皮膚をハサミで切り、引き戻して前腹壁を露出させます。
腹腔を開くために正中線を切開します。はさみを使用して、胃と近位十二指腸の間、および結腸と肛門の間を切って腸全体を切り離します。次に、指を使って腸をそっと引き出し、水道水の入ったシャーレに入れます。
腸の切片を縦に切り開き、水道水で少なくとも10秒間激しく振って、糞便や粘液を洗い流します。洗浄した腸切片を20ミリリットルの水道水が入った50ミリリットルのチューブに移し、インキュベートします。3時間のインキュベーション後、腸組織を水から取り出します。
チューブを室温で垂直に置き、寄生虫を重力で30分間沈殿させます。チューブに約5ミリリットルの水が残るまで上清を吸引します。.チューブに水道水を総量25ミリリットルまで補充します。
サスペンションの視界がはっきりしたら、約5ミリリットルの水が残るまで上清を吸引します。.この液体を、線でマークされた6ウェルプレート内のマウス腸ごとに2つのウェルに移します。倒立顕微鏡で40倍の倍率で成虫の雌寄生虫を数え、井戸の底に描かれた線に沿って移動させます。
幼虫は感染後1日目に初めて頭部から検出され、均一な分布を示し、肺からもごく一部が回収されました。感染後2日目には頭部の幼虫の数が有意に増加し、平均して頭部に174匹、肺に17匹の幼虫がいました。頭部内の幼虫の数は感染後3日目までに著しく減少し、4日目までに頭部から回収された幼虫はいませんでした。
寄生虫は感染後4日目から腸内で検出され、大多数は十二指腸に局在し、空腸の最初の3分の2は6日目まで持続しました。感染後7日目までに、ほとんどの成虫寄生虫は盲腸に局在し、9日目まで持続し、11日目までにその数が大幅に減少し始めました。感染後14日目に腸から寄生虫の成虫は回収されず、この時点までに腸内寄生虫の総数はゼロに減少しました。
まず、Strongyloides rattiに感染したラットを、感染後5日目と12日目にセルロースを数層に重ね、トイレ砂を最小限に抑えたケージに入れます。感染後6日目から8日目および13日目から15日目に、ラットを新しいケージに移し、古いケージからすべての糞便ペレットを回収します。1つのケージから収集した糞便を1本の50ミリリットルチューブにプールします。
あらかじめ浸した活性炭を取り、洗ってから使用してください。糞便を事前に浸した活性炭と等量混ぜます。混合物を斜めに配置して勾配を形成し、活性炭の追加層で覆って最終的な比率を1対2にします。
次に、ガラスビーカーを透明なフィルムで覆い、適切な空気循環を可能にするために空気穴が開けられていることを確認します。
