Name: analyzing the effects of stromal cells on the recruitment of leukocytes from flow
Uploaded: 2015-01-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
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Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women's Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

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The authors declare that they have no conflicts of interest.

ここでは、炎症を起こした内皮によって循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。我々は以前、TNFαで刺激されたEC 9,29を通じて用量依存的に好中球の接着の増加と転生を観察している。また、両モデルは、白血球動員上の間質細胞の効果を研究するために適合させることができる方法について説明します。ここでは、MSCは、Ibidiのマイクロスライドまたは多孔質フィルターの両側にECと共培養した。これは、両方の細胞型は、それによって互いの表現型応答を改変する、相互に通信することを可能にする。私たちは、MSCの存在は、TNFαで刺激されたECへの好中球の接着を抑制したことを、ここに示されており、これまでの研究23できた。これは間質細胞は、EC応答を改変することを示していますその後サイトカインおよびへの循環白血球の動員を変更します。 上述のモデルに加えて、Cellixバイオチップ、Bioflux板とGlyotechパラレルプレートフローチャンバーは、内皮細胞を培養し、動員を観察するための表面を提供する市販の流路システムである。すべてのシステムでは、特定のパラメータは、内皮培養物を確立し、以下および以前の報告30,31で強調表示され、そのうちのいくつかのフローベースの接着アッセイを実行する一方で考慮されるべきである。サイトカイン応答に影響を与える可能性ヒドロコルチゾンなどの任意の抗炎症剤は、培養およびアッセイ18,29の間、培地から除外されるべきである。これらはEC単層を崩壊させるように、ECの培養中の流路に存在する気泡がないことを確認マイクロスライドIbidiを使用している場合。 cytokiする内皮単層の完全性を確認すべきである前に、NE-治療、好中球はBSAがマイクロスライド/フィルタをコーティングしており、単層のギャップに結合するであろうように。これは、TNFαは温度感受性であり、唯一の37℃での最大効果を有するため、ECは、サイトカイン刺激を通して37℃に維持されることを保証することも重要である。フローアッセイ自体については、適切な洗浄バッファーを選択し、我々は一般的に短いアッセイ（未満30分）となりましたアッセイのためにBSA（0.15％）を補充したM199培地のためのPBSAを使用します（1から48時間）30,31。最後に、これは流量、損害賠償のEC単層を破壊し、付着性好中球を活性化させるようにアッセイ中の流路に存在する気泡がないことを確認。 ここで説明した多細胞のインビトロモデルの主要な利点の1つは、ECおよび間質細胞の間でのインビボ相互作用を複製する能力である。それは、 インビボで特定の間質成分の影響を分離することは困難であるそして制御された方法でそれらを変更します。我々のモデルでは、間質細胞は、ECと通信し、健康および疾患における炎症プロセスに影響を与えるかを解明するために操作することができる。例えば、我々は以前に、共培養中にMSCによりIL-6の産生を示したsiRNA技術を用いて、それらの免疫抑制効果は23のために必要であった。各モデルは、特定の問題、すなわち、白血球動員に組織常駐間質細胞（フィルタベースのモデル）または治療的に投与ストローマ細胞（Ibidiマイクロスライドと他の市販のシステム）の効果に対処するために使用することができる。両方の場合では、それらの生存を確実にするために、採用15,25への影響を評価するためのECにストローマ細胞の適切な比率を確立するために、異なる間質細胞型を滴定している。同様に、培養培地は、モデルに組み込まれた各細胞型との互換性が必要です。我々の手で共培養は、典型的には、間質細胞メートルで行われるedium 11,18,23,31。 フィルタベースのモデルを使用して、我々は以前に、種々の間質細胞は、組織特異的に白血球の接着および遊走を支持し、これらの効果は、慢性疾患3において変化なるようにするECの能力を調節することが示されている。これは、間質細胞が活発に炎症組織24への白血球の動員を調節する組織特異的な「アドレスコード」を確立するという概念をもたらした。これらのモデルは、具体的には非常に詳細に募集の初期段階を調べるために設計されたが、（組織の中に離れて内皮からの、すなわち ）内皮下スペース内の後続の移行を検討することはできませんされている。そのような静的なコラーゲンゲルアッセイ12,32などの多細胞、多層3D構築物は、動員これらの後者の段階を研究するためのより適切であろう。 当社のフローベースの接着のモデルは非常に汎用性があります。私たちは、DESを持っている好中球動員の文脈におけるそれらの使用をcribedが、他の白血球サブセットは、同様の方法で調べることができる。また、EC 23によりMSC循環の動員を調査するIbidiのマイクロスライドシステムを使用し、これは、同じ接着カスケードを介して発生しているか否かの白血球について報告されている。同様に、これらのモデルは、動員および転移性腫瘍細胞株の取り込み、および内皮応答および白血球動員に対するそれらのその後の効果を調べるために使用することができる。あるいは、フィルタベースのモデルは、健康な組織13,21および疾患11,18,20の部位から間質細胞の異なるタイプ（ 例えば、線維芽細胞、有足細胞、平滑筋細胞）を組み込むように適合させることができる。これはECおよび/または白血球上のレベルで作用する組織特異的調節経路の研究を可能にする。全ての場合において、疾患状態の範囲の通常の調節プロセスの破壊は、ケを識別するために調べることができるそして潜在的な新しい治療標的（例えば、IL-6およびTGFβなど）yの規制のメディエーター。慢性炎症の文脈では、これらの薬剤は、癌生物学における一つの腫瘍を標的とするために募集をオンにするためのそれらの使用を想像しながら、採用プロセスをスイッチオフするために使用され得る。

炎症は、微生物感染または白血球に入ると解像度1,2を可能にするために炎症を起こした組織からの出口の厳しい規制を必要とする組織損傷に対する防御応答である。内皮細胞（EC）、その行血管、循環白血球および組織常駐間質細胞の間のクロストークは、このプロセス3を調整するために不可欠である。しかし、白血球およびそれらの無効なクリアランスの制御されない動員は、慢性炎症性疾患4の発展を支える。健康および疾患における白血球動員の我々の現在の理解は不完全であり、より堅牢なモデルは、このプロセスを分析するために必要とされる。 後毛細血管細静脈の血管ECを通して血液から白血球の動員を支援するメカニズムはよく1,2,5に記載されている。循環白血球は、特殊な受容体（ 例えば、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン）によって捕捉される炎症性内皮上にアップレギュレートされている。これらの一時的な相互作用は、白血球が表面に結合したケモカインおよび白血球、6- 11で表さインテグリンを活性化する脂質由来メディエーター（起源の内皮または間質のいずれか）と対話することを可能にする。これは、次に接着性を安定化し、内皮を横断し、組織12〜15への移行を駆動する。組織内では、白血球がそれらの運動性、機能および生存16,17に影響を与える間質由来物質にさらされている募集。成長している証拠は、信号は、次のために募集プロセス条件白血球の各段階で受信したことを示唆している。しかし、白血球動員の我々の理解は不完全のままと非常に少ないが、組織内のコンポーネント整形白血球の動きについて知られている。 バーミンガムでは、からの白血球の動員を研究するためのin vitroでのいくつかの「血管」モデルを開発してきました流れ9,18,19。私たちは現在、白血球動員の血管のEC行為として即時の規制当局は、地元の微小環境の変化に対応していることを理解しています。具体的には、組織常駐間質細胞が活発に動員3におけるそれらの役割に影響を与えるために、隣接する血管ECと会話によって部分的に、炎症反応を調節することができる。我々は以前、様々な間質細胞は、組織特異的に接着および白血球の移動をサポートするECの能力を調節することが示されており、これらの効果は、慢性疾患13,16,20,21における変化したことになる。このように、間質細胞を各炎症反応22のコンテキストを定義する組織「アドレスコード」を確立する。より最近では、我々は、骨髄由来MSC（BMMSC）は強力両方の好中球の動員の低下につながる、サイトカインに対するECの応答をダウンレギュレートし、23リンパ球ことを実証した。 メカニズムGOVerning募集が明らかにin vitroでは、主に分離して単一の細胞型（ 例えば、EC）またはタンパク質を組み込んだアッセイを使用している。しかし、これらの研究を考慮に入れていない局所組織環境の影響（ すなわち、間質細胞の存在）の白血球の動員に関する組織へのそれらのその後の移行。ここでは、間質細胞は、特に間葉幹細胞た二フローベースの方法（MSC）を表すEC 23と共培養する。このようなモデルは、流れから白血球動員をサポートするために、特に能力、我々は、内皮応答に対する間質細胞の効果を調べることを可能にする。

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type Ia</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 &amp;deg;C in 1 ml aliquots.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.</td></tr><tr><td>1X Medium M199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Gentamicin sulphate</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Add to M199 500 ml bottle.</td></tr><tr><td>Human epidermal growth factor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in 10 &amp;micro;l aliquots.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 &amp;deg;C. Store in 10 ml aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 &amp;deg;C in 1 ml aliquots.</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td>Stock is in ethanol. Store at -20 &amp;deg;C in 10 &amp;micro;l aliquots.</td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td>Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 &amp;deg;C in 100 &amp;micro;l aliquots.</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3631</td><td>Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 &amp;deg;C in 100 &amp;micro;l aliquots.</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m cell strainer for 50 ml centifuge tube</td><td>Scientific Lab Supplies (SLS)</td><td>352360</td><td>Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.</td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Biosera</td><td>LM-D1102/500</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin mix</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in 1 ml aliquots.</td></tr><tr><td>25 cc tissue culture flask</td><td>SLS</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>75 cc tissue culture flask</td><td>SLS</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Bone marrow mesenchymal stem cells vial</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.</td></tr><tr><td>Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.</td></tr><tr><td>EDTA (0.02%) solution</td><td>Sigma</td><td>E8008</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Trypsin solution</td><td>Sigma</td><td>T4424</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Greiner bio-one</td><td>2019-02</td><td>Keep on ice before adding before adding cell suspension.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 &amp;deg;C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile</td><td>Ibidi</td><td>IB-80606</td><td>Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).</td></tr><tr><td>Cell tracker green dye</td><td>Life technologies</td><td>C2925</td><td>Store in 5 &amp;micro;l aliquots at -20 &amp;deg;C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 &amp;deg;C) MSCGM.</td></tr><tr><td>Cell counting chambers</td><td>Nexcelom</td><td>SD-100</td><td>Alternatively a haemocytometer can be used.</td></tr><tr><td>Cellometer auto T4 cell counter</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4-203-0238</td><td></td></tr><tr><td>Tumor necrosis factor &amp;alpha; (TNF&amp;alpha;)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>210-TA-100</td><td>Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 &amp;deg;C in 10 &amp;micro;l aliquots.</td></tr><tr><td>6-well, 0.4 &amp;micro;m PET Transwell filters</td><td>SLS</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>K2-EDTA in 10ml tubes</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Store at RT.</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm to RT before use.</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Warm to RT before use.</td></tr><tr><td>10 ml round bottomed tube</td><td>Appleton Woods</td><td>SC211 142 AS</td><td></td></tr><tr><td>7.5% BSA Fraction V solution</td><td>Life technologies</td><td>15260-037</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>20 ml Plastipak syringes</td><td>BD falcon</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Plastipak syringes</td><td>BD falcon</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Plastipak syringes</td><td>BD falcon</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm</td><td>Micropore</td><td>1530-1</td><td>Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.</td></tr><tr><td>Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68854</td><td>Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.</td></tr><tr><td>Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB68855</td><td></td></tr><tr><td>Portex Blue Line Manometer tubing</td><td>Smiths</td><td>200/495/200</td><td>Tubing leading to the syringe pump.</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>BOC Ohmeda AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass 50 ml syringe for pump</td><td>Popper Micromate</td><td>550962</td><td>Must be primed prior to use by removing any air bubbles.</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Raymond A Lamb</td><td></td><td>26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.</td></tr><tr><td>Parafilm gasket</td><td>American National Can Company</td><td></td><td>Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 &amp;micro;m.</td></tr><tr><td>Two perspex parallel plates</td><td>Wolfson Applied Technology Laboratory</td><td></td><td>Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.</td></tr><tr><td>Electronic 3-way microvalve with min. dead space</td><td>Lee Products Ltd.</td><td>LFYA1226032H</td><td>Electronically connected to a 12 volt DC power supply.</td></tr><tr><td>Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2001</td><td>Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.</td></tr><tr><td>L-shaped connector</td><td>Labhut</td><td>LE876</td><td>To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.</td></tr><tr><td>Video camera</td><td>Qimaging</td><td>01-QIC-F-M-12-C</td><td>Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td>Media Cybernetics</td><td>41N70000-61592</td><td>For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.</td></tr><tr><td colspan="4">Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.</td></tr></tbody></table>

analyzing the effects of stromal cells on the recruitment of leukocytes from flow

間質細胞は、隣接する内皮細胞とのクロストークを通じて炎症の間に循環白血球の動員を調節する。ここでは、炎症を起こした内皮細胞によって流れから循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。また、両方のモデルは、白血球動員を調節する際に、この場合、間葉系幹細胞（MSC）は、間質細胞の役割を研究するために適合させることができる方法を記載している。 初代内皮細胞は、Ibidiマイクロスライド上または24時間トランスウェルフィルターの両側に直接接触したヒトMSCを単独で、または一緒に培養した。培養物を、4時間、腫瘍壊死因子α（TNFα）で刺激し、フローベースの接着アッセイに組み入れた。好中球のボーラスを灌流した4分間の内皮上。好中球と内皮との相互作用を流れるの捕獲は位相差顕微鏡により可視化した。 両方のモデルでは、サイトカイン刺激は、用量依存的に流れる好中球の内皮細胞の動員を増加させた。動員された好中球の挙動の分析は、ローリングの用量依存的減少および内皮を通じて遊走の用量依存的増加を示した。共培養では、MSCは、TNFαで刺激された内皮への好中球の接着を抑制した。 当社のフローベースの接着モデルが循環から白血球動員の初期段階を模倣する。白血球に加えて、彼らはそのような治療的に投与MSCまたは循環腫瘍細胞のような他の細胞型の動員を調べるために使用することができる。我々の多層共培養モデルは、MSCが炎症性サイトカインに対する応答を変更するために内皮と通信することが示されている、alteri好中球の動員をngの。このようなモデルを用いてさらに研究が完全に炎症中の白血球の動員をどのように影響するか、間質の異なる組織や条件から細胞（炎症性疾患または癌）を理解するために必要とされている。

当初、我々はIbidiのマイクロスライドモデル（ - 9第7節 ） を使用して、フローからの好中球の募集にTNFαでECを刺激する効果を分析した。 TNFα、任意の好中球は、内皮単層に付着した小さな場合（ 図2A）の非存在下で。これは、25,26を結合サポートするために必要な接着分子（セレクチン）またはケモカインを発現しないEC休止/未処理として、期待された。対照的に、サイトカイン刺激は、用量依存的に有意に（ 図2A）において内皮への好中球の接着を増加させた。接着は通常、検定の過程で安定している。未処理の内皮への白血球の結合は、ECが活性化されるのいずれか（ すなわち、培養プロセス中のLPSで汚染）および/ ​​または好中球は、分離プロセス中に活性化されたことを示している。実際に、LPSは、E-セレクチン、ICAM-1の発現およびVCを増加させることが示されたAM-1、それらが好中球に結合することができるようにECの表面上の25-27。 募集好中球の挙動を分析するとき、私たちは通常、内皮単層（ 図2C）を通って移動する好中球の割合で併用投与量依存的に増加した（ 図2B）をローリング好中球の割合の用量依存的な減少を観察します。 TNFα刺激（1 U / ml）での低用量での好中球の大きな割合は、それらが内皮細胞（ 図2B）の頂端表面に付着していることを示す位相明るく現れる。対照的に、10および100 U / mlの（より高い用量）で補充された好中球の約40％は、これらの細胞は、内皮単層を通って移動し、内皮細胞（ 図2C）の下にあることを示す2分で相が暗く見える。転生がmに達すると、2分 - 好中球は、1内のECを通過して移動することができます〜の10分の後灌流28時aximalレベル。ここでは、9分後に灌流（ 図2C）を2分で40％から60％の好中球遊走の増加を観察した。好中球 - （12ミクロン/分〜10）私たちは（〜3程度/秒）ローリングの速度にTNFα濃度の何の効果も認められなかっまたは移行。 フィルタベースのモデルにおいて、TNFα刺激は、Ibidiのマイクロスライドモデル（ 図3A）を使用して見られるのと同様の用量依存的に好中球の接着を増加させた。パーセント遊走の用量依存的増加（ 図3C）が観察された一方で挙動に関して、好中球のローリングは、TNFα投与量（ 図3B）によって影響されなかった。この一連の実験において、我々は、好中球遊走（ 図3C）上の時間の有意な効果は観察されない。 我々は2つ​​の異なる共培養構築物を生成する方法の方法のそれぞれを提供するその具体的な質問に答えるように工夫されている。 Ibidiのマイクロスライドモデルでは、EC及びMSCは、互いに直接接触している単一の単層で培養される。このモデルは、血中へのMSCの治療注入の効果とEC単層へのそれらのその後の統合を検討するのに便利です。フィルタベースのモデルでは対照的に、ECおよびMSCは近接フィルタの両側の培養が、必ずしも直接接触している。これは、より密接に、内皮細胞が血管を表す単分子層を形成することで、組織に似ており、MSCは、内皮下の区画に存在する。これは、私たちは、サイトカイン刺激に対するECの応答上の組織常駐MSCの効果を調べることができます。 私たちの経験に基づいて、我々は、ECが100 U / mlのTNFαで刺激されると、最大の好中球動員及び経内皮移動が発生することを確認します。このように、我々は、MSCの共培養の効果を調べるために、この濃度を使用しているフローからの好中球の内皮募集に関する。ここでは、マイクロスライドとフィルタベースのモデルを使用してECの共培養でBMMSCのデータを提示するが、MSCの他のタイプはまた、例えば、WJMSC調べることができる。 EC単独で培養された（ 図4A）と比較した場合、両方のモデルにおいてBMMSCの存在は、ECへの好中球の接着を減少させた。圧延および遊出の同様のレベルは単独で培養EC上で観察またはMSC（ 図4BおよびC）とを共培養は、動員された好中球の挙動に影響を及ぼさなかった。したがって、MSCは、流れから好中球動員を支持する能力を抑制するサイトカイン刺激に対するEC応答を変更することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52480/52480fig1highres.jpg" /> 図1. EC-MSCの共培養の確立及びフローベースの接着アッセイを使用して、好中球動員を分析する。（A） </（i）の主要なEC及び組織培養フラスコ上で増殖させた（ii）の継代3 BMMSCの強い&gt;顕微鏡写真。、6ウェルトランスウェルフィルターインサート上で培養EC及びMSCの（B）の顕微鏡写真。生成するために使用される灌流システムの（C）図フローからECへの動員を次のフロー（FA）にしっかりと付着した（i）の（D）の平行平板フィルタフローチャンバの略図。（E）顕微鏡写真、および（ii）（TM）遊出好中球は、100 U / mlのTNFαで刺激。 画像CとD分子生物学の方法では、図2及び図3から取得されます：。スプリンガー科学とビジネス·メディアからの親切な許可を得て、T細胞移動、2010、PG 53-54 28 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52480/52480fig1large.jpg" target="_blank">本の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。</a> Ibidiマイクロスライドを用いてTNFαで刺激されたECのフローから図2の好中球の動員 ECTNFαの濃度を増加させながら刺激した。 - 4時間（0〜100 U / ml）を。好中球の4分のボーラスは0.05 PaのEC単層の上に灌流した。2分で評価（A）好中球の接着。 ANOVAは、好中球の接着はp &lt;0.01でのTNFα処置の有意な効果を示した。好中球の動作は2,9分で評価し、（B）ローリングまたは（C）遊出した接着細胞のパーセンテージとして表した。 ANOVAは、接着性好中球はp &lt;0.001の挙動にTNFα処置の有意な効果を示した。 Cでは、ANOVAは転生した好中球P &lt;0.01でかなりの時間を示した。データは、n = 3の実験から平均値±SEMである。 *はp &lt;0.05および**ダネット事後検定によって刺激されていない（0 U / ml）のEC対照と比較してp &lt;0.01。##はp &lt;0.01および###ボンフェローニポストによって同じ時点で1 U / mlのECと比較してp &lt;0.001テスト。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52480/52480fig3highres.jpg" /> フィルターベースアッセイを用いてTNFαで刺激されたECのフローから図3の好中球の動員 ECTNFαの濃度を増加させながら刺激した。 - 4時間（0〜100 U / ml）を。好中球の4分のボーラスは0.1 PaのEC単層の上に灌流した。2分で評価（A）好中球の接着。 ANOVAは、好中球の接着はp &lt;0.001でのTNFα処置の有意な効果を示した。好中球の動作は2,9分で評価し、（B）ローリングまたは（C）遊出した接着細胞のパーセンテージとして表した。 Cでは、分散分析翔好中球の遊出の時刻とサイトカイン処置の有意な効果を結婚に、p &lt;0.05。データは、n = 3の実験から平均値±SEMである。 **はp &lt;0.01および***はp &lt;ボンフェローニポストによって同じ時点で1 U / mlのECと比較してダネット事後検定。＃（p &lt;0.05）であることによって刺激されていない（0 U / ml）のEC対照と比較して0.001 -test。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52480/52480fig4highres.jpg" /> TNFαで刺激されたEC-BMMSCの共培養への流れから図4.好中球動員を。BMMSC前4時間100U / mlのTNFαでの刺激に24時間ECと共培養した。好中球の4分のボーラスは（A、C、E）マイクロスライド0.05 Paと（B、D、F）フィルタ0.1 PaのEC単層を介して灌流した。（AB）、好中球の接着は、2分で評価した。好中球の挙動は2と9メートルで評価された及び（CD）ローリングまたは遊出（EF）であった接着細胞の割合として表した。 C及びDにおいて、ANOVAは、好中球のローリングはp &lt;0.05での培養条件の有意な効果を示した。 E及びFにおいて、ANOVAは、好中球の遊出、p &lt;0.05での時間の有意な効果を示した。しかし、有意差はボンフェローニ事後検定によって、個々の治療間の遊出は観察されなかった。データは、n = 5の実験から平均値±SEMである。 * P &lt;0.05、対応のあるt検定またはボンフェローニポストテストによるECの単一栽培に比べて。 好中球のローリング速度の補足動画1.分析トランスウェルフィルター上で培養ECで4時間、100 U / mlのTNFαで刺激した。好中球のボーラスは、4分のためにECの上に灌流した。単一の10秒フィールドの代表デジタル化シーケンスは2を取っ分後に灌流。 10秒シーケンスの開始から終了までの単ローリング好中球の位置の変化は、好中球ローリングされた速度を計算するために使用することができる。 好中球遊走速度の補足動画2解析 ECを4時間100 U / mlのTNFαで刺激したトランスウェルフィルター上で培養した。好中球のボーラスは4分間ECかけて灌流した。遊出した好中球の移動を追跡するために、単一の5分間のフィールドの代表的なデジタル化された配列。これは速度を計算するために使用することができる。

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Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K ビュー.  University of Birmingham. 流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。 

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Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

発生生物学

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

生物工学

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

ネズミリンパ節間質細胞の単離

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

免疫・感染学

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

モデル化学療法抵抗性白血病<em&gt;インビトロ</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

医学

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...