このプロトコルは、げっ歯類の筋肉組織中の骨格筋間質性細胞外小胞を分離し、精製することを目的としています。この細胞外小胞は、診断バイオマーカーや治療手段としての潜在的な応用により、筋肉のヒトの状態の疾患メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。この標準化されたプロトコルにより、収量、サイズ、貨物組成、機能など、さまざまな筋肉サンプル間で骨格筋由来のEVの特性を分析および比較することができます。
これらの結果は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおけるそれらの役割についての理解を深め、これらのEVを診断バイオマーカーとしての適用も促進します。当研究室では、高純度・高収率の骨格筋間質性細胞外小胞を効率的かつ時間効率よく確実に作製することに注力します。私たちは、特に神経筋障害の文脈で、それらの病理学的役割と治療の可能性を探求することを目指しています。
まず、安楽死させたマウスの脚を滅菌プレートに固定し、脚の前面を上に向けて固定します。解剖ハサミを使用して、マウスの足首の外側の皮膚に5ミリメートルの小さな切開を行います。はさみの1枚の刃を切開部に挿入し、皮膚の下、筋肉組織の上に配置します。
次に、皮膚を膝に向かって上向きに切り込み、切開部を伸ばします。粗いピンセットを使用して、切開部に沿って皮膚をつかみ、筋肉が見えるまで引き戻して開口部を広げます。次に、膝から足首まで、脛骨の外側に沿って走っている前脛骨筋、またはTA筋を見つけます。
鋭利なピンセットを使用して、TA筋を覆っている結合組織をつかみ、慎重に剥がします。足首の近くで、TA筋に接続されているTA腱と、外側のTA腱の隣にある小さなEDL腱を特定します。解剖ハサミを使用して、両方の腱を切断します。
ラフエンドのピンセットを使用して、両方の腱をつかみます。別のピンセットで、腱を慎重に分離し、TAをEDLから分離します。次に、切断したばかりの腱でTA筋をラフエンドピンセットで持ち上げます。
解剖ハサミを使用して膝近くのTA腱を切断し、筋肉を取り除きます。次に、脚を放し、マウスを反転させて、脚の後側が上を向くようにします。皮膚の一部をすでに取り除いた状態で、解剖ハサミを使用して足首付近に残った皮膚を切ります。
切り取った皮膚を粗いピンセットでつかみ、膝の後ろに向かって上向きに剥がし、腓腹筋を露出させます。解剖ハサミを使用して、足首近くの腓腹筋腱を切断します。粗いピンセットで腓腹筋腱をつかみ、上に持ち上げて腓腹筋の下側を露出させます。
次に、腓腹筋の下の小さなヒラメ筋腱、腓腹筋がまだ接続されている膝の近くに配置します。解剖ハサミを使用してヒラメ筋腱を切断し、ヒラメ筋を上向きに収縮させます。切断されたヒラメ筋腱を鋭利なピンセットでつかみ、軽く持ち上げてヒラメ筋を腓腹筋の下側から切り離します。
解剖ハサミを使用してヒラメ筋の端を切断し、腓腹筋の切断された端に付着し、2つの筋肉を完全に分離します。解剖ハサミを使用して、膝近くの腓腹筋の端を切り取り、氷上のPBSに入れます。膝から下の4つの筋肉を切除した後、マウスを裏返して前面を上に向けます。
マウスの脚を90度の角度に配置して、大腿四頭筋を強制的に曲げます。解剖ハサミを使用して、膝に最も近い腱を切断します。次に、大腿四頭筋を大腿骨から分離するために、近位腱だけが付着するまで筋肉と骨の間を切断します。
解剖ハサミを使用して近位腱を切断し、大腿四頭筋を切除します。除去したすべての筋肉をPBSで数回すすぎ、毛皮や血液などの汚染物質を取り除きます。ペーパータオルで筋肉をやさしく乾かします。
鋭利なピンセット、破片ピンセット、メス、またはハサミを使用して、筋肉サンプルから腱を穏やかに取り除くことから始めます。次に、ハサミまたはメスを使用して、筋繊維に沿って一方の腱からもう一方の腱まで、筋肉を縦方向に1ミリメートルの厚さに切断します。消化酵素緩衝液を調製するには、2ミリグラムのコラゲナーゼ、DMEM1ミリリットルあたり2酵素を1%ペニシリンストレプトマイシン溶液と混合します。
混合後、0.2マイクロメートルのフィルターで溶液をろ過します。筋肉組織をアリコートに分離し、それぞれに20ミリグラムの筋肉が含まれています。調製したバッファーを1ミリリットルずつ各アリコートに加え、酵素解離およびインキュベートします。
新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブを準備し、ラベルを付けます。5ミリリットルの注射器からプランジャーを取り外して、0.45マイクロメートルのフィルターをセットアップします。シリンジハブを0.45マイクロメートルフィルターの上端にねじ込み、フィルターの下端をラベル付きの微量遠心チューブに配置します。
次に、混合物を1000 Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離し、破片をペレット化します。P-200マイクロピペットを使用して、上清をシリンジに移します。プランジャーをシリンジに再挿入した後、上清をゆっくりとフィルターに押し込み、ラベル付きの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。
シリンジプランジャーを再度取り外します。P-200マイクロピペットを使用して、約200マイクロリットルのPBSをシリンジに加えます。プランジャーを再度挿入し、200マイクロリットルのPBSをフィルターにゆっくりと押し込み、残りの上澄みをラベル付きの微量遠心チューブに洗い流します。
ろ過した溶液を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、最大200、000 Gの速度に適しています。マイクロ超遠心機の電源を入れ、100, 000 G、摂氏4度で1時間稼働するように設定します。ロードされたローターをチューブと一緒にマイクロ超遠心分離機内に置きます。
蓋を閉め、バキュームをオンにしてプロセスを開始します。真空度がレベル2に達したら、スタートボタンを押して遠心分離プロセスが完了するのを待ちます。遠心分離サイクルが完了したら、真空ボタンをクリックしてチャンバーを再加圧してから、ローターとチューブを取り外してください。
P-200マイクロピペットを使用して、各チューブから上清を慎重に取り除きます。次に、同じP-200マイクロピペットを使用して、各チューブに50マイクロリットルのPBSを追加します。
