Combining Imaging and Electrophysiology to Visualize and Record Spreading Depolarizations in Mice

私たちの研究の範囲は、脳モデルを使用して、脱分極の拡大と軽度の外傷性脳損傷との関係を理解することです。私たちのグループらは最近、マウスの軽度の閉鎖頭蓋骨損傷で脱分極の広がりが起こることを示しました。一般的に使用されるin vivo電気生理学増幅器は、拡散する脱分極に関連するゆっくりとした細胞外シフトをフィルタリングするため、拡散する脱分極を検出することはほぼ不可能です。

このプロトコルの利点は、イメージングとin vivo電気生理学の両方を活用して、軽度の外傷性脳損傷後の広がる脱分極の有無を確認できることです。私たちは、MTBIに関連する急性行動、病理、および長期的な認知障害における脱分極の拡大の役割を理解し始めています。まず、麻酔をかけた動物を脳定位固定装置フレームに置き、加熱パッドを使用して動物の体温を維持します。

10番のメスの刃を使用して、吻側から尾側への正中線に沿って切開を行います。そしてすぐにシアノアクリレート接着剤を切開部に塗布します。次に、皮膚を横に広げて頭蓋骨を露出させます。

頭蓋骨にシアノアクリレート接着剤を1〜2滴追加して、保護を強化します。接着剤が乾燥している間に、滅菌手術用ハサミを使用して、小脳の切開サイズを大きくします。次に、0.8mmのドリルビットを使用して、頭蓋骨に下穴を開け、ネジを頭蓋骨に回します。

余分なワイヤーをネジの周りに巻き付けて、後でヘッドステージを配置するために多少のたるみを確保します。すべての頭蓋骨ネジを所定の位置に取り付けたら、すべての金色のピンを目的のヘッドステージコネクタに差し込みます。定位固定装置アームでコネクタを所定の位置に保持し、ワイヤが接触しないようにコネクタピンをネジ頭の上の近くに配置します。

シアノアクリレート接着剤で全体をシールし、頭蓋骨ネジの前のイメージング領域が乱されないようにします。金ピンの基部の周りに歯科用セメントを積み上げ、頭蓋骨のネジからの金ピンがヘッドステージの金ピンに接続されないようにします。ヘッドステージコネクタを取り外す前に、歯科用セメントが硬化するのを待ちます。

まず、IOSコンピューターとLEDパネルボードの電源を入れます。電極を埋め込んだ麻酔動物をカメラの下のインパクトベッドに取り付けます。そして、皮質表面を覆うようにフォーカスリングを調整します。

固有の光信号、またはIOS設定をロードした後、ライブボタンを押してマウスを表示し、動物の頭蓋骨をカメラの中央に配置します。次に、Multi-D Acquisitionを押して取得設定にアクセスし、目的の時点を選択します。指定されたファイルパスに、適切な名前プレフィックスを付けて画像を保存します。

動物からの金色のピンをヘッドステージコネクタに接続し、次にヘッドステージに接続します。電気生理学コンピュータの電源を入れ、コンピュータを電気生理学機器に接続します。Intanソフトウェアの設定を読み込んだ後、[ファイル形式の選択]アイコンをクリックし、ポップアップウィンドウで[信号タイプ形式ごとに1ファイル]を選択します。

次に、[BW]タブの[ハードウェア帯域幅]で、0.13〜500ヘルツのアンプ帯域幅を選択します。[フィルター ディスプレイ セレクター] で [ワイド] を選択します。ローパスフィルターとハイパスフィルターを設定したら、[ファイル名の選択]アイコンをクリックして、保存するファイルパスを選択します。

衝撃は、電磁インパクターをONにし、レバーをフリックして、先端が適切に引っ込めて伸びるか確認してください。動物をフォームベッドに素早く置き、ベッドをインパクターの先端の下にスライドさせます。インパクターの先端を正中線に合わせ、ブレグマの1ミリメートルの吻側に配置します。

次に、インパクターの先端を下げて、動物の頭のてっぺんにしっかりと触れます。レバーを押してインパクターの先端を引っ込め、手動で5mm下げてからインパクトレバーを作動させます。すぐに動物をフォームベッドから取り出し、カメラの下に置いて5秒以内にイメージングします。

「Acquire」をクリックして、「Multi-Dimensional Acquisition」ウィンドウでIOSイメージングを開始します。4分間の画像をキャプチャして、拡散する脱分極イベント全体を記録します。電気生理学の記録を開始するには、Intanソフトウェアの[記録]アイコンをクリックします。

録音が完了したら、動物をヘッドステージとコネクタから抜き、ケージに戻します。画像スタックを開くには、[ファイル]をクリックし、[インポート]と[画像シーケンス]をクリックします。カーソルを使用して正方形を描画し、関心領域を定義して、拡散する脱分極のプロットを生成します。

[Image] に移動し、[Stacks] に移動し、[Plot Z-axis Profile] に移動してグラフをプロットし、[Live] ボタンをクリックします。生成されたプロットで、List をクリックして値のリストを生成します。視覚化するには、グレースケール画像を火のルックアップテーブルで変換します。

広がりのある脱分極は、窓を通して皮質と大きな血管を横切って伝播することが観察されました。電気生理学記録における高頻度活性は、イソフルラン除去後の偽動物で迅速な回復を示しました。しかし、脱分極した動物では、回復するまでの数分間、高頻度の活動が抑制されたままでした。

パワープロットは、両方の条件で抑制からの回復後にパワーが明らかに上昇したことを示しました。