El alcance de nuestra investigación es comprender la relación entre las despolarizaciones que se propagan y las lesiones cerebrales traumáticas leves utilizando modelos cerebrales. Nuestro grupo y otros han demostrado recientemente que las despolarizaciones que se propagan ocurren en lesiones leves de cráneo cerrado en ratones. Los amplificadores de electrofisiología in vivo comúnmente utilizados filtrarán los cambios extracelulares lentos asociados con las despolarizaciones en expansión, lo que hace casi imposible detectar la despolarización en expansión.
La ventaja de este protocolo es aprovechar tanto la imagen como la electrofisiología in vivo para confirmar la ausencia o presencia de despolarizaciones dispersas después de una lesión cerebral traumática leve. Hemos comenzado a comprender el papel de las despolarizaciones generalizadas en el comportamiento agudo, la patología y los déficits cognitivos a largo plazo asociados con los MTBI. Para comenzar, coloque al animal anestesiado en un marco estereotáxico y mantenga la temperatura corporal del animal con una almohadilla térmica.
Con una hoja de bisturí número 10, haga una incisión a lo largo de la línea media desde la rostral hasta la caudal. E inmediatamente aplique pegamento de cianoacrilato a la incisión. Luego, extiende la piel lateralmente para exponer el cráneo.
Agregue una o dos gotas adicionales de pegamento de cianoacrilato sobre el cráneo para brindar protección adicional. Mientras se seca el pegamento, use tijeras quirúrgicas estériles para aumentar el tamaño de la incisión sobre el cerebelo. A continuación, con una broca de 0,8 milímetros, perfore agujeros piloto a través del cráneo y gire los tornillos en el cráneo.
Enrolle el exceso de alambre alrededor del tornillo, dejando algo de holgura para la colocación de la etapa de la cabeza más tarde. Una vez que todos los tornillos de calavera estén en su lugar, conecte todos los pines dorados en el conector de etapa de cabeza deseado. Sosteniendo el conector en su lugar con el brazo estereotáxico, coloque las clavijas del conector cerca de las cabezas de los tornillos sin contacto con el cable.
Selle toda el área con pegamento de cianoacrilato, asegurándose de que el área de imagen frente a los tornillos del cráneo no se altere. Acumula cemento dental alrededor de la base de los alfileres de oro, asegurándote de que los alfileres de oro de los tornillos del cráneo no estén conectados a los de la etapa de la cabeza. Deje que el cemento dental se cure antes de quitar el conector de la etapa principal.
Para comenzar, encienda la computadora IOS y la placa del panel LED. Monte el animal anestesiado implantado con electrodos en un lecho de impacto debajo de la cámara. Y ajuste el anillo de enfoque para cubrir la superficie cortical.
Después de cargar la señal óptica intrínseca o la configuración de IOS, presione el botón Live para ver el mouse y centrar el cráneo del animal debajo de la cámara. A continuación, pulse Adquisición Multi-D para acceder a la configuración de adquisición y seleccionar los puntos de tiempo deseados. Guarde las imágenes en la ruta de archivo designada con el prefijo de nombre adecuado.
Conecte los pines dorados del animal al conector de la etapa principal y luego a la etapa principal. Encienda la computadora de electrofisiología y conecte la computadora al equipo de electrofisiología. Después de cargar la configuración del software Intan, haga clic en el icono Elegir formato de archivo y, en la ventana emergente, seleccione Un archivo por formato de tipo de señal.
A continuación, en la pestaña BW en Ancho de banda de hardware, seleccione el ancho de banda del amplificador de 0,13 a 500 hercios. Seleccione Ancho en Selector de pantalla de filtro. Después de configurar los filtros de paso bajo y alto, haga clic en el icono Seleccionar nombre de archivo para seleccionar la ruta de archivo deseada para guardar.
Para el impacto, encienda el impactador electromagnético y mueva la palanca para verificar si la punta se retrae y se extiende correctamente. Coloque rápidamente al animal en una cama de espuma y deslice la cama por debajo de la punta del impactador. Alinee la punta del impactador con la línea media y colóquela a un milímetro de bregma.
Luego, baje la punta del impactador hasta que toque firmemente la parte superior de la cabeza del animal. Empuje la palanca para retraer la punta del impactador, luego bájela manualmente cinco milímetros antes de activar la palanca de impacto. Retire inmediatamente al animal de la cama de espuma y colóquelo debajo de la cámara para obtener imágenes en cinco segundos.
Haga clic en Adquirir para iniciar la creación de imágenes de IOS en la ventana de adquisición multidimensional. Capture imágenes durante cuatro minutos para registrar todo el evento de despolarización en propagación. Para iniciar el registro de electrofisiología, haga clic en el icono Grabar en el software Intan.
Una vez finalizada la grabación, desconecte el animal de la etapa principal y del conector y vuelva a colocarlo en su jaula. Para abrir la pila de imágenes, haga clic en Archivo, seguido de Importar y Secuencia de imágenes. Dibuje un cuadrado con el cursor, definiendo la región de interés, para generar el gráfico de la despolarización en dispersión.
Vaya a Imagen, seguido de Pilas, y Trazar perfil del eje Z para trazar el gráfico y haga clic en el botón En vivo. En la gráfica generada, haga clic en Lista para generar una lista de valores. Para la visualización, convierta la imagen en escala de grises con una tabla de búsqueda de incendios.
Se observaron despolarizaciones que se propagaban a través de la corteza y grandes vasos sanguíneos a través de la ventana. La actividad de alta frecuencia en los registros de electrofisiología mostró un rápido retorno en los animales simulados después de la eliminación de isoflurano. Pero en los animales despolarizados, la actividad de alta frecuencia permaneció suprimida durante varios minutos antes de la recuperación.
Los diagramas de potencia demostraron un claro aumento de la potencia después de la recuperación de la supresión en ambas condiciones.
