オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

このプロトコルでは、特別な近接でタンパク質システインと反応する新しい手として作用できるスルホニウム塩が構築されました。この技術の利点は、この反応が迅速かつ効率的であり、メット触媒を含まず、ペプチドを安定化するための簡単で効率的な方法を開発したことでした。まず、20%ピペリジンまたは50%モルホリンとDMFのN末端9-フルオリニル-メチルオキシカルボニル脱保護溶液を500ミリリットルのビーカーまたはフラスコに調製します。

次に、10ミリリットルの脱保護溶液をカラムに加え、窒素を溶液に30分間または2回5分間バブリングします。真空ポンプで溶液を排出し、ジクロロメタンとN,N-ジメチルホルムアミドで樹脂を5回連続洗浄します。樹脂を濃い黄色の溶液として検出するには、少量の樹脂に1ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、ガラス管に200マイクロリットルの5%ニンヒドリンを加えます。

130°Cで3分間加熱し、樹脂の色の変化を評価します。ペプチドのカップリングのために、ポリプロピレンチューブ中の原稿に記載されているように混合溶液を調製し、それを3ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解する。次に、173マイクロリットルのN,N-ジイソプロピルエチルアミンまたは154マイクロリットルのN,N'-ジイソプロピルカルボジイミドを溶液に加えて、アミノ酸を不活性化します。

次に、混合物を樹脂と共にカラムに加え、窒素で2時間泡立てる。カップリング後、少量の樹脂に1ミリリットルのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、ガラス管に200マイクロリットルの5%ニンヒドリンを加えます。樹脂が無色に変化している間、摂氏130度で3分間加熱し、脱保護ステップの前に遊離アミノ基がないことを確認します。

溶液を排出した後、前述のように樹脂を洗浄し、10ミリリットルの脱保護溶液をカラムに加えます。次に、窒素で30分間または2回5分間泡立てます。そして再び、新しい解決策を追加します。

脱水のために樹脂と共に10ミリリットルの無水メタノールをカラムに加え、次の使用のために窒素で乾燥させる。100ミリグラムの樹脂をカラムに計量し、カップリングステップの前にジクロロメタンとN,N-ジメチルホルムアミドで樹脂を洗浄します。保護基を除去するための100ミリリットルのビーカーまたはフラスコにトリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシラン、およびジクロロメタン混合物を加えて、トリチル-L-システイン保護基を除去するための溶液を調製します。

調製した溶液を5〜10ミリリットルカラムに加え、保護基を10分間除去します。黄色が完全に消えるまで窒素バブリングで6回繰り返します。真空ポンプで溶液を排出した後、前述のように樹脂を洗浄します。

次いで、N,N-ジメチルホルムアミドと共に50ミリリットルのビーカーまたはフラスコにジハロゲン化リンカーとN,N-ジイソプロピルエチルアミンを加えて脱保護システインと反応させるための溶液を調製する。5〜10ミリリットルの反応溶液をカラムに加え、保護されたシステインと窒素バブリングで少なくとも3時間反応させます。再度、真空ポンプで溶液を排出し、前述のように樹脂を順次洗浄します。

ペプチド環化溶液を調製するには、ペプチド環化用のドラフト内の20ミリリットルのビーカーまたはフラスコにトリフルオロ酢酸混合物を追加します。次に、5〜10ミリリットルの混合溶液をポリプロピレンチューブに加え、トリフルオロ酢酸カクテルの下で樹脂を3時間切断します。カップリング工程が実証される前に樹脂を脱水および洗浄した後、1%ギ酸水溶液と1ミリモルの臭化プロパルギルを調製し、メチオニンペプチド溶液に加えます。

次に、メチオニンと臭化プロパルギルのカップリング反応を室温で12時間振とうする。反応後、生成物をポリプロピレンチューブとアセトニトリルに溶解し、0.22マイクロメートルのフィルター膜でろ過します。その後、直ちに逆相HPLCで溶液を精製し、次の使用のために粉末に凍結乾燥します。

システインとメチオニンの間のビスアルキル化を用いて合成された環状ペプチドは、HPLCおよびLCMSスペクトルによって特徴付けられ、エピマーは明確な保持時間と同一の分子量を示したことを示しています。エピマーとそのコンジュゲート生成物のHPLCトレースは、環状ペプチドとその生成物との間の時間依存的な変換を示しました。チオール-イン型反応を用いて合成した環状ペプチドの分子量をLCMSにより測定し、ペプチドをHPLCにより単離精製した。

ペプチドはさらに、プロトンNMRとヘテロ核単一量子コヒーレントスペクトルによって特徴付けられ、化学シフトを明らかにしました。環状ペプチドとジチオスレイトールおよび酸化重水素との間の時間依存的変換のプロトンNMRスペクトルが得られ、スルホニウム環の開環によるペプチドの安定性を調べた。結果は、24時間後に付加または開環生成物が形成されないことを示した。

この手順は、環状ペプチドを合成するための効果的な戦略を確立しました。この反応は、環化ペプチドを安定化させることの確認を形成することにより選択性も増強したと言い、環状ペプチドが有望な薬物触媒であったことを示している。