この方法は、ジスルフィドリッチペプチドの合成や、対応するジスルフィドブリッジパターンの決定など、ペプチド合成分野における重要な質問に答える助けとなります。この技術の主な利点は、異なるジスルフィド結合結合ペプチド異性体およびその後の化学的および構造的特徴付けの選択的合成を可能にすることです。一般的に、この方法に新しい個人は、各ジスルフィドリッチペプチドが異なった振る舞いをするので苦労します。
合成および分析は、個々のペプチドまたはタンパク質に対して部分的に最適化されなければならない。テキストプロトコルに記載されている試薬を対応する容器に移し、固相ペプチド合成機の適切なラケットに入れる。その後、反応カラムに100ミリグラムの乾燥樹脂を加え、シンセサイザーのラケットに入れます。
テキストプロトコルで詳述されているように、固相ペプチド合成を開始します。合成が完了した後、一晩、樹脂を凍結乾燥させた。今樹脂からペプチドを切断し、サイドチェーンの深い保護を行います。
これを行うには、乾燥樹脂を12ミリリットルのチューブに入れ、氷の上で摂氏0度に冷却します。まず、スカベンジャー混合物の150マイクロリットルを追加し、次に樹脂の100ミリグラムあたり95%トリフルオロ酢酸の1ミリリットルを追加します。混合物を室温で3時間静かに振ったままにしておきます。
次に、ガラスのフリットを通して混合物をフィルタリングします。チューブに濾液を収集し、氷冷ジエチルエーテルで個別に8〜10ミリリットルのジエチルエーテルあたり1ミリリットルの切断混合物で満たします。ペプチドは白色の固体として沈殿する。
テキストプロトコルに記載されているようにチューブをリンスおよび遠心した後、ペプチドを凍結乾燥させる。半前質クロマトグラフィーでリニア前駆体を精製するために、粗ペプチドの約70ミリグラムを15ミリリットルのチューブに加える。その後、粗ペプチドを0.1%TFAに溶解し、1対1のアセトニトリルを水に溶かします。
1分間に10ミリリットルの流量で120分間にわたってゼロから50%の溶離Bの勾配を使用してペプチド混合物を分離する。個々のチューブに分数を収集し、テキストプロトコルに記載されているように、質量分析とHPLC分析のために選択した分数を準備します。分数をフリーズドライし、ピア分数を組み合わせます。
第1酸化を行うことにより、二硫化物結合の選択的形成を開始する。これを行うには、イソプロパノール水混合物の105ミリリットルに凍結乾燥リニアペプチドの15ミリグラムを溶解する。12〜48時間、基本的な条件下で空気中で攪拌混合物を残します。
段階的酸化手順は非常に重要です。反応制御は、個々の異化物が豊富な形成を確実にするために、3つの酸化ステップすべてで取られる。3回目の酸化は、最適な反応時間を超えると二硫化スクランブリングが起こり得るため、最も重要です。
次に、2回目の酸化を行います。イソプロパノール水の105ミリリットル、1モル塩酸混合物に凍結乾燥ペプチドの15ミリグラムを溶解する。メタノールに0.1モルヨウ素溶液158マイクロリットルを加えます。
酸化が完了するまで室温で反応を攪拌します。次に、1モルアスコルビン酸を水中に79マイクロリットル加えて反応を停止します。最後に第3酸化を行う。
スカベンジャー混合物を含むTFAの5.5ミリリットルに凍結乾燥ペプチドの15ミリグラムを溶解する。8~10ミリリットルのジエチルエーテルにつき1ミリリットルの反応溶液で、冷たいジエチルエーテルを含むチューブにペプチドを沈殿させます。15ミリリットルチューブに凍結乾燥粗生成物の15ミリグラムでペプチド精製を行う。
粗生成物をHPLCサンプルループの体積に溶解し、0.1%TFAと1対1のアセトニトリルを水に混合して溶解します。完全に溶解するまでボルテックスした後、3400倍のG.5ミリリットルシリンジで3.6ミリリットルの混合物を引き出し、注入ループに気泡を入れずにサンプルを注入して、溶液を遠心分離します。HPLC システムへの注入を開始します。
1分間に10ミリリットルの流量で120分間にわたってゼロから50%の溶出Bの勾配を使用してペプチド混合物を精製する。表示される個々のチューブの分数を収集します。実行が完了したら、テキストに記載されているように、MSおよびHPLC分析のために選択された分数を準備します。
すべての分数を凍結乾燥し、マイナス20度で保存します。分析HPLCを実行するには、ペプチド画分または反応制御のサンプルをHPLCバイアルに移し、それを1対1のアセトニトリルの混合物に溶解します。分析リバース相HPLCセットのオートサンプラーにHPLCバイアルを入れ、各サンプルの250マイクロリットルを注入します。
アセトニトリルの0.1%TFAの溶離性Aとして水中に0.1%TFAの勾配溶出システムを使用し、1分間に1.0ミリリットルの流量で30分間にわたって10%〜40%の溶離Bの勾配を使用してペプチドを分析します。アミノ酸分析を行うために、純粋なペプチドの100マイクログラムを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、200マイクロリットルの6モルHCLの粉末を溶解する。溶液をガラスアンプルに移した後、バンゼンバーナー炎で首を加熱してアンプルを閉じます。
その後、加水分解のために摂氏110度で24時間加熱ブロックにアンプルを保持するガラス管を置きます。24時間後、アンプルを開き、溶液を2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。回転真空濃縮器で60°Cで6時間、G210倍の溶液を遠心分離します。
次いで、192マイクロリットルのサンプリングされた希釈バッファーに加水分解物を溶解し、溶液をマイクロ遠心フィルターに移します。試料を2300倍Gで1分間遠心した後、100マイクロリットルの濾液をアミノ酸分析サンプルチューブに移します。チューブをアミノ酸分析装置に入れ、分析を開始します。
この過去の還元プロトコルでは、質量分析を介してその後のジスルフィド分析に不可欠なカッパミドメチル化種を2〜4回得るために、いくつかの反応制御を取ることが重要です。まず、TCEPを含む0.05モルクエン酸バッファーの1.2ミリリットルに純粋なペプチドの600マイクログラムを溶解します。ゼロから30分の範囲の数100マイクロリットル反応制御サンプルを室温でインキュベートします。
1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに300マイクロリットルのアルキル化バッファーを混ぜて反応を停止し、遊離チオール基のカルボニルメチル化を行います。100マイクロリットルの100マイクロリットルの10%TFAと水を加えて5分後に反応を停止し、サンプルをドライアイスに保存します。テキストプロトコルで詳しく説明されているように、サンプルに対してHPLCを実行します。
酸化された形態のMS/MS分析のために、収集された各分率を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に少量移動する。残りのペプチドを0.1%TFAに溶解し、100ミリモルTCEP溶液上に適切な体積を加えて、最終的なTCEP濃度10ミリモルを得る。この時点で、選択的システインアルキル化は、ペプチドシーケンシングを介してチェックすることができる。
2つのペプチドを中間にして、二硫化物ブリッジパターンの決定が可能である。異なる異性体のNMR分析は、個々のペプチド構造を明らかにするために行われる。エネルギーが最も低い20の構造と異性体のジスルフィド接続性が示されている。
特に、逆相HPLC MS/MSフラグメンテーションとNMR分析の組み合わせは、ジスルフィド接続性の明確な同定のために必要とされます。二乗平均平方偏差値の比較により、硬質ペプチドが主により良い解決されたNMR構造を導くことが明らかになっています。このビデオでは、所望のジスルフィド結合パターンを持つペプチドを選択的に合成する方法を示す必要があります。
また、テンダー質量分析を介して正しいジスルフィド接続性をチェックし、NMR分光法を介して三次元構造を得る可能性を示す。その開発後、この技術は、ペプチド合成の分野の研究者が三次元構造のためのジスルフィド結合パターンの重要性を探求し、結果的にそのようなペプチド異性体の活性を探求する道を開いた。この手順に従って、活性ASASのような他の方法は、特定の生物学的標的における異なるペプチド異性体の構造活性関係に関する洞察を得るために行うことができる。
この方法はコノトキシンの合成および分析に関する洞察を提供することができるが、フェンゼン、ジスルフィドが豊富な動物毒素および他の複数のシステイン含有分子のような他のジスルフィドブリッジペプチドおよびタンパク質にも適用することができる。
