硫化水素生成細菌の高感度視覚的検出法

硫化水素生成細菌は、硫黄含有アミノ酸およびタンパク質を利用して硫化水素を生成することができる。ここでは、細菌中の硫化水素を高感度かつ簡便に検出する方法を確立しました。この方法は、96ウェル透明マイクロタイタープレートを使用した硫化ビスマス沈殿の修正版です。

菌培養物をL-システインを含むビスマス溶液と合わせ、20分間培養したところ、最後に黒色沈殿物が観察された。手順を実演するのは、私たちの研究室の研究助手であるWei Zhuです。細菌コロニーをLuria-BertaniまたはLB寒天プレートから100ミリリットルのLB培地に移すことから始め、細菌濃度が約10億細胞/ミリリットルになるまで摂氏37度で12〜16時間培養します。

トリプチカーゼ大豆ブロスまたはTSB寒天プレートからフソバクテリウム・ヌクレアタムとプロテウス・ブルガリスの細菌コロニー1個を100ミリリットルのTSB培地に移し、細菌濃度が約10億細胞/ミリリットルになるまで嫌気的に37°Cで24時間培養します。96ウェルマイクロタイタープレートで100マイクロリットルの細菌培養物を100マイクロリットルの新しく調製したビスマス溶液と混合し、摂氏37度で20分間培養します。各細菌株について、3回に分けて分析を行う。

20分後、色の変化を確認します。溶液の色が淡黄色から黒色に変わった場合、これは細菌が硫化水素またはH2Sを生成できることを示しています。この測定を3回繰り返します。

硫化ビスマス溶液と混合した異なる濃度の水硫化ナトリウムを使用して、方法の感度を決定します。最後に、黒色硫化ビスマス沈殿物の形成を観察することにより、二硫化物および硫化物イオンの存在を決定します。ウェルの色を、無色から最も暗い黒色生成までの視覚的なスケールを使用してスコア付けします。

硫化水素試験の性能は、選択された細菌株の純粋培養物を用いて調査された。その結果,サルモネラ菌B,フソバクテリウム・ヌクレアタム,エンテロコッカス・フェカリス,緑膿菌,尋常性プロテウスは硫化水素を生成し,黒硫化ビスマス沈殿物が生成することが示された。一方、サルモネラ・パラチフスA、黄色ブドウ球菌、アエロモナス・ハイドロフィラ、および肺炎桿菌は黒色沈殿を示さなかった。

この方法の主な利点は、複製が容易で、特殊な機器を必要としないことです。