細菌からの組換えタンパク質の精製は、十分に確立された方法である。ただし、これらの手法を使用すると、いくつかの問題が発生する可能性があります。組織からタンパク質を抽出する方法を持つことは確かに魅力的です。
この方法の主な利点は、そのフォールディングおよび触媒活性に影響を与える可能性のあるすべての相互効果を含む、その生理学的形態でタンパク質を抽出できることである。このアプローチは、目的の他のタンパク質に適合させ、他の組織に対して改変してもよい。組織から精製されたタンパク質は、高品質の抗体および薬理学的阻害剤の開発をサポートし得る。
開始するには、250ミリリットルのPBSを50ミリモルのフッ化ナトリウム、1ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオリド、1ミリリットル当たり2マイクログラムのアプロチニン、および1ミリモルの活性化オルトバナジン酸塩と混合することによってタンパク質溶解緩衝液を調製する。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットを使用して溶液をろ過します。組織1グラムあたり2ミリリットルの溶解バッファーでチューブを準備し、氷の上に置きます。
組織サンプルを調製するために、ポリスチレンフォームボックス内の氷上に置かれた予め洗浄されたガラス板上にそれぞれ約100ミリグラムの組織を解剖する。その後の溶解のために組織片を調製したチューブに移す。飽和硫酸アンモニウム溶液を調製するために、500ミリリットルの二重蒸留水を摂氏70度に加熱する。
攪拌しながら、硫酸アンモニウムが溶解しなくなるまで硫酸アンモニウム粉末を徐々に加える。この飽和溶液を室温まで冷却し、摂氏4度で一晩保存する。豚腎臓組織を均質化するために、好ましくは試料を氷上に保ちながら超音波プローブによって懸濁液を超音波処理する。
マウスの肝臓組織の場合は、電気ホモジナイザーを使用し、PBSで定期的に洗浄して、サンプルを氷上に保管しながら目詰まりを防ぎます。サンプルから20マイクロリットルを取り出し、均質化された組織の細胞が適切に破壊されているかどうかを顕微鏡で確認します。それ以外の場合は、均質化を繰り返します。
チューブを10,000倍のGで4°Cで30分間遠心分離します。上清を新鮮なチューブに集め、氷の上に置きます。続いて、0.45マイクロメートルおよび0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットを使用して上清をろ過する。
上清を10ミリリットルのバッチにアリコートし、短期保存の場合は摂氏マイナス20度、長期保存の場合は摂氏マイナス80度で凍結します。SDS-PAGEまたはウェスタンブロット分析用に50マイクロリットルのサンプルを用意するには、SDSサンプルバッファーの5倍量を10マイクロリットルの上清に加え、95°Cで10分間煮沸します。製造元の指示に従って、不連続な12.5%ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲルを調製する。
SDS−PAGE分析を行うために、続いてゲルのウェルにタンパク質マーカーラダーをロードし、5ナノグラムのヒトFAHD1組換えタンパク質をポジティブコントロールとして、20マイクロリットルのサンプルを分析対象として、残りのウェルに20マイクロリットルの調製されたSDS−PAGEサンプルバッファーをロードする。SDS ランニングバッファを使用して、SDS-PAGE ゲルを 125 ボルトで実行します。SDS−PAGEが完了した後、ウェスタンブロット分析を行い、FAHD1に対して惹起された利用可能な抗体を用いて膜をプローブする。
前述のように上清アリコートを調製した後、解凍後の処理か、または試料を凍結せずにタンパク質抽出の直後に処理する。0.22マイクロメートルのフィルターユニットを使用してサンプルをろ過し、解凍後に起こりうる沈殿物を排除します。氷上に6本の1.5ミリリットルのチューブを準備し、250マイクロリットルのサンプルを各チューブに移します。
調製したチューブに硫酸アンモニウムの希釈シリーズを調製し、タンパク質溶解緩衝液で最終容量を1,000マイクロリットルにする。サンプルを摂氏4度でチューブローテーター上で一晩インキュベートします。卓上遠心分離機を用いて、摂氏4度で30分間、10,000倍Gで遠心分離し、すべての上清を別々のチューブに慎重に移した。
得られたペレットを空気乾燥し、それぞれを1,000マイクロリットルの二重蒸留水に再懸濁する。前のステップからの再懸濁ペレットおよび上清の各ペアについて、40マイクロリットルとSDSサンプルバッファーの5倍の10マイクロリットルを混合し、液体の大部分が気化するまで開いた蓋で摂氏95度で沸騰させる。次いで、ペレットを二重蒸留水中の50%ジメチルスルホキシドの混合物に再懸濁する。
再懸濁ペレットおよび上清に由来するサンプルをペアでロードすることによってSDS−PAGEを行い、続いてウェスタンブロット分析を行った。ただし、ゲルを80ボルトで3時間実行してください。FPLCシステムをアニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムでセットアップします。
20%エタノールの5つのカラム容量で20%エタノールでカラムを洗浄し、続いて5カラム容量のダブル蒸留水で洗浄します。注入またはサンプルポンプを使用してサンプルをカラムに塗布し、フロースルーを収集します。カラムを 1 カラム容量の低塩緩衝液で洗浄します。
3 つのカラム容量内で、100% 低塩バッファーから 100% 高塩バッファーへのリニアグラジエント溶出を設定します。1ミリリットルの分画を連続的に収集します。グラジエントが終了したら、1カラム容量の範囲にわたってクロマトグラムにタンパク質関連ピークが検出されなくなるまで、高塩バッファーで実行を続けます。
0.5モルの水酸化ナトリウムと二重蒸留水に溶解した1ミリリットルの25%SDSを塗布してカラムを洗浄します。3 つのカラム容量の二重蒸留水と 3 つのカラム容量の 20% エタノールで、2 つの蒸留水でカラムを連続して洗浄します。すべてのピークフラクションとフロースルーのSDS-PAGEサンプルを収集します。
回収した画分を液体窒素中でスナップ凍結し、マイナス80°Cで保存します。ウェスタンブロットを介してそれらをプローブした後、目的のタンパク質を含む画分を解凍してプールし、他のものを廃棄する。精製ステップを実行するには、超遠心分離フィルターユニットを使用してタンパク質溶液の体積を2ミリリットルまで減らします。
0.45マイクロメートルおよび0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットで溶液を順次ろ過し、微量沈殿を除去します。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、1ミリモルのジチオスレイトールを含む1カラム容量のランニングバッファーで平衡化する。サンプルをカラムにロードし、前述のようにすべてのタンパク質が溶出するまでクロマトグラフィーユニットを実行します。
前述のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析用に50マイクロリットルのサンプルを準備します。1カラム容量の二重蒸留水と1カラム容量の20%エタノールで20%エタノールで連続してカラムを洗浄します。ウェスタンブロット分析を実施した後、全てのFAHD1含有画分をプールする。
超遠心フィルターユニットを使用して、タンパク質溶液の体積を2ミリリットルまで減らします。ウェスタンブロットスクリーニングは、上清中にブタFAHD1の存在を示し、バンドは25キロダルトンで、タグ付き陽性対照は34キロダルトンで実行される。溶解物からのブタFAHD1を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、結合タンパク質を溶出により除去した。
ブタFAHD1を含む画分をウェスタンブロット分析により同定し、プールし、濃縮した。タンパク質サンプルをSECにより精製し、ウェスタンブロット分析により同定した。豚FAHD1タンパク質の収量は約1ミリグラムで、純度は80%でした。
ウェスタンブロット分析は、マウスFAHD1タンパク質を他のタンパク質と共にフロースルー中に検出した。フロースルーをサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。FAHD1を含む画分をプールし、濃縮し、SDS−PAGE分析に適用した。
しかし、タンパク質の収量はあまり高くなかった。豚FAHD1の特異的酵素活性は、全タンパク質当たりのFAHD1の相対量を増加させると純度レベルとともに増加する。硫酸アンモニウムのより高い濃度は、より低い電圧で解決することができる笑顔効果を引き起こす。
さらにタンパク質が15%濃度で溶解液および上清中に見出された。しかし、より高い濃度では、サンプルが沈殿し、検出できないことがあります。ここで提示されたプロトコルは、タンパク質が解けることを要求する。
クロマトグラフィーの沈殿およびpHまたはサイズ調整に最適な条件を試験および定義する必要があります。酵素機能の研究、タンパク質構造の調査、抗体の開発は、細菌から抽出されたタンパク質ではなく組織から抽出されたタンパク質を有する場合に大きく支持される。
