バイオサーファクタントは、液体の表面張力および2つの異なる相間の間隙張力を低下させる能力を有する微生物によって産生される共感性表面活性分子である。これらの分子の共感的な性質は、それらが2つの異なる相間の界面で自分自身を整列させ、ある相の別の相への可溶化を強化することを可能にする。バイオサーファクタントは、それらが提供する様々な利点のために、それらの化学的対応物と比較して多くの注目を集めている。
これらには、より高い特異性、より低い毒性、より大きな構造多様性、調製の容易さ、より高い生分解性、それらのより高い環境適合性、および環境の極端な条件下でのそれらの活性が含まれる。このビデオでは、ロドコッカス、リシニバチルス、パエニバチルスの異なる株によって産生されるスクリーニング、特性評価、および適用バイオサーファクタントに関与する方法を実証します。我々はさらに、サンドパックカラム技術による残留油の回収におけるこれら3つの微生物株によって産生されるバイオサーファクタントの組み合わせの適用を評価する方法を例示する。
この作業は、Preeti Srivastava博士とManoj Kumar博士の指導の下で行われてきました。微生物の成長のために、1ミリリットルのオートクレーブ処理されたルリアブロスを含むフラスコに接種し、一晩成長させた種培養物を層流キャビネット内のフラスコに加えることによって接種する。フラスコを摂氏30度および180RPMの回転式インキュベーターで7日間インキュベートする。
培養期間終了後、フラスコを回収し、培養液を遠沈管に移す。培養物を4で遠心分離し、摂氏4度の冷蔵遠心分離機で20分間500G。無細胞上清を新鮮なビーカーに穏やかに注ぎ、バイオサーファクタント産生のスクリーニングアッセイに使用します。
ドロップ崩壊アッセイによるバイオサーファクタント産生をスクリーニングするために、きれいなスライドガラスを取り、スライドの表面を200マイクロリットルの油でコーティングする。次に、20マイクロリットルの無細胞上清を油の中心に加え、2〜3分間邪魔されずに放置する。滴が崩壊した場合は、上清をバイオサーファクタントの存在に対して陽性とスコア付けする。
油展延アッセイでは、20ミリリットルの二重蒸留水をペトリプレートに取り、水面に200マイクロリットルの原油を加える。次に、20マイクロリットルの無細胞上清を油の中心に加え、1分間邪魔されずに放置する。油の変位の結果として透明化ゾーンが形成された場合は、バイオサーファクタントの存在について上清を陽性とスコア付けします。
エマルジョンインデックスアッセイでは、ガソリンおよび無細胞上清をそれぞれ4ミリリットルを清潔なガラス管に加える。その後、混合物を3分間激しくし、次の24時間邪魔されずに放置します。無細胞上清の表面張力を測定するには、表面張力が決定される液体でガラス容器を洗浄する。
液体を容器に加え、容器ホルダーに容器を取り付けます。プローブホルダーのロックを解除し、プローブを取り付けます。手動コントローラを使用して、プローブが液体の表面から2〜3ミリメートル離れるように、プラットフォームの高さを調整します。
次に、ソフトウェアに移動し、論文に記載されている手順に従って表面張力を測定します。測定が完了したら、プラットフォームの高さを下げ、プローブと容器を装置からロック解除して取り外します。バイオサーファクタントの抽出のために、無細胞上清のpHを2つに調整し、2つの通常の塩酸を使用する。
混合物を摂氏4度で一晩保存する。翌日、メタノール混合物に等量のクロロホルムを加え、20分間激しく混合する。混合物を邪魔しないで、自由な分離が起こるようにしてください。
水とメタノールを含む上面を取り除き、下面はバイオサーファクタントを含むままにして、ヒュームフードで蒸発させます。有機相の蒸発後、蜂蜜色のバイオサーファクタントを3ミリリットルのクロロホルムに再溶解し、この混合物をバイオサーファクタントの特性評価および同定に使用する。抽出されたバイオサーファクタントのクロマトグラフィー特性評価のために、TLCプレート上に20マイクロリットルのバイオサーファクタントをスポットする。
プレートを乾燥させた後、クロロホルムメタノール混合物で飽和させたチャンバー内にTLCプレートを置き、TLCを稼働させた。脂質検出のために、ヨウ素の顆粒を新鮮なチャンバーに加え、チャンバーを5〜10分間飽和させる。TLCをチャンバー内に置き、黄色の斑点の発生を観察します。
タンパク質と炭水化物を検出するには、TLCプレートに非水素またはアニスアルデヒドをスプレーし、摂氏110度で加熱し、色の発達を観察します。NMR分析の場合は、チューブをスパナに挿入します。調整されたチューブを使用してチューブの高さを調整します。
NMRチューブとスパナをMRマシンに置き、論文に記載されている手順に従ってNMRスペクトルを取得します。強化されたオイル回収実験のために、ガラスカラムを取り、底部出口をグラスウールとガラスビーズで密封する。土の上部に液体を加えることができるように、砂質の土で柱を戻します。
ホルダーに柱を取り付け、土の上にガラスビーズを加えます。カラムに 50 ミリリットルのブライン溶液を流し込み、流れを集めて不良体積を判断します。原油を強制的に通過させて、カラムからブラインを取り除きます。
カラムから出てくる塩水と油の量を集めて、初期油飽和量を決定します。24 時間後、カラムに 10 個の貧弱な量の塩水を入れ、カラムから出てくるオイルを収集して二次オイル回収率を推定します。二次油回収後にカラムに残された油分が残油に相当する。
次に、抽出したバイオサーファクタントをガラスビーカーに添加してバイオサーファクタントの混合物を調製する。そして、バイオサーファクタントと混合物をカラムに加え、次の24時間それを邪魔しないで放置する。24 時間後、カラムから流出した油と水の量を測定して、油の回収率の追加または強化を判断します。
3つの微生物株の無細胞上清は、滴崩壊、油拡散およびエマルジョン形成をもたらしたため、バイオサーファクタントの存在について陽性とスコア付けされた。バイオサーファクタント産生の確認は、無細胞ブロスの表面張力の測定により提供した。ロドコッカスおよびリシニバチルスの増殖のために、培地の表面張力は1メートルあたり59mNから45mNに低下した。
パエニバチルスの増殖により、培地の表面張力は1メートルあたり59から28.4mNに低下した。乳化安定性アッセイは、3つの微生物株によって産生されるバイオサーファクタントが、多様かつ環境条件下で大きな安定性を示すことを示した。乳化指数は、インキュベーション温度、pH、および無細胞ブロスの塩濃度が変化した場合、有意な変化を示さなかった。
抽出されたバイオサーファクタントのDLC特性評価は、3つの株すべてによって産生されたバイオサーファクタントがグリコリペドであることを示した。バイオサーファクタントの化学的同定は、ロドコッカスとリジンバチルスがラムノリピッドとして同定された同じバイオサーファクタントを、約4つの80ダルトンの質量で産生することを示した。一方、パエニバクチルスは、約802ダルトンの質量を有する3つの脂質鎖を含むラムノリピッドを産生する。
バイオサーファクタントの組み合わせは、砂のカラムから残留油の56.5%を回収することができた。ロドコッカス、ルシニバチルス、およびパエニバチルスの株からのバイオサーファクタント産生をアッセイし、そして該株をバイオサーファクタントの産生について陽性とスコア化した。産生されたバイオサーファクタントは、ラムノ脂質として特徴付けられ、同定された。
バイオサーファクタントの組み合わせは、サンドパック技術で残留油の56%を回収することに成功したので、バイオサーファクタントの組み合わせは、油貯蔵庫の内部に閉じ込められた残留油を回収するためにフィールド用途で使用することができる。
