Biotenside sind die empathischen oberflächenaktiven Moleküle, die von Mikroorganismen produziert werden, die die Fähigkeit haben, die Oberflächenspannung der Flüssigkeit und die interfizielle Spannung zwischen zwei verschiedenen Phasen zu reduzieren. Die empathische Natur dieser Moleküle ermöglicht es ihnen, sich an der Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen Phasen auszurichten und die Solubilisierung einer Phase in eine andere zu verbessern. Biotenside haben im Vergleich zu ihren chemischen Gegenstücken aufgrund verschiedener Vorteile, die sie bieten, viel Aufmerksamkeit erregt.
Dazu gehören eine höhere Spezifität, eine geringere Toxizität, eine größere strukturelle Vielfalt, eine einfache Zubereitung, eine höhere biologische Abbaubarkeit, ihre höhere Umweltverträglichkeit und ihre Aktivität unter extremen Umweltbedingungen. In diesem Video demonstrieren wir die Methoden des Screenings, der Charakterisierung und der Anwendung von Biotensiden, die von verschiedenen Stämmen von Rodococcus, Lysinibacillus und Paenibacillus produziert werden. Wir veranschaulichen ferner die Methoden zur Bewertung der Anwendung der Kombination von Biotensiden, die von diesen drei mikrobiellen Stämmen bei der Rückgewinnung von Restöl durch eine Sandpacksäulentechnik erzeugt werden.
Die Arbeiten wurden unter der Leitung von Dr. Preeti Srivastava und Dr. Manoj Kumar durchgeführt. Für das Wachstum von Mikroben impfen Sie die Kolben mit hundert Millilitern autoklavierter Luria-Brühe, indem Sie einen Milliliter über Nacht gewachsene Samenkultur in den Kolben im laminaren Luftstromschrank geben. Inkubieren Sie die Kolben in einem Drehbrutschrank bei 30 Grad Celsius und 180 U / min für sieben Tage.
Nach Abschluss der Inkubationszeit die Kolben ernten und die Kulturbrühe in die Zentrifugenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.500 G für 20 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den zellfreien Überstand vorsichtig in ein frisches Becherglas und verwenden Sie ihn in Screening-Assays für die Biotensidproduktion.
Für das Screening der Biotensidproduktion durch einen Tropfenkollaps-Assay nehmen Sie einen sauberen Glasobjektträger und beschichten Sie die Oberfläche des Objektträgers mit 200 Mikrolitern Öl. Geben Sie nun 20 Mikroliter zellfreien Überstand in die Mitte des Öls und lassen Sie es zwei bis drei Minuten ungestört. Wenn der Tropfen kollabiert, bewerten Sie den Überstand positiv auf das Vorhandensein von Biotensid.
Nehmen Sie beim Ölausbringungsassay 20 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in eine Petriplatte und fügen Sie 200 Mikroliter Rohöl auf die Wasseroberfläche hinzu. Fügen Sie nun 20 Mikroliter zellfreien Überstand in die Mitte des Öls hinzu und lassen Sie es eine Minute lang ungestört. Wenn eine Clearingzone als Folge von Ölverdrängung gebildet wird, bewerten Sie den Überstand positiv für das Vorhandensein von Biotensid.
Im Emulsionsindex-Assay fügen Sie jeweils vier Milliliter Benzin und zellfreien Überstand in ein sauberes Glasröhrchen hinzu. Dann was die Mischung kräftig für drei Minuten und lassen Sie es ungestört für die nächsten 24 Stunden. Zur Messung der Oberflächenspannung des zellfreien Überstandes reinigen Sie das Glasgefäß mit der Flüssigkeit, deren Oberflächenspannung zu bestimmen ist.
Fügen Sie die Flüssigkeit in das Gefäß hinzu und montieren Sie das Gefäß auf dem Gefäßhalter. Entsperren Sie den Sondenhalter und montieren Sie die Sonde darauf. Stellen Sie mit dem manuellen Controller die Höhe der Plattform so ein, dass die Sonde zwei bis drei Millimeter von der Oberfläche der Flüssigkeit entfernt ist.
Gehen Sie dann zu Software und folgen Sie den im Papier genannten Schritten, um die Oberflächenspannung zu messen. Senken Sie nach Abschluss der Messung die Höhe der Plattform ab und entriegeln und demontieren Sie die Sonde und das Gefäß vom Instrument. Für die Extraktion von Biotensid stellen Sie den pH-Wert des zellfreien Überstands auf zwei ein, wobei Sie zwei normale Salzsäure verwenden.
Lagern Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag fügen Sie das gleiche Volumen der Chloroform-Methanolmischung hinzu und mischen Sie kräftig für 20 Minuten. Lassen Sie die Mischung ungestört, damit eine freie Trennung stattfinden kann.
Entfernen Sie die obere Oberfläche, die Wasser und Methanol enthält, und lassen Sie die untere Oberfläche, die Biotensid enthält, in einem Abzug verdampfen. Nach der Verdampfung der organischen Phase das honigfarbene Biotensid in drei Milliliter Chloroform wieder auflösen und dieses Gemisch zur Charakterisierung und Identifizierung des Biotensids verwenden. Zur chromatographischen Charakterisierung des extrahierten Biotensids finden Sie 20 Mikroliter Biotensid auf TLC-Platten.
Nachdem Sie die Platten getrocknet haben, legen Sie die TLC-Platte in die mit Chloroform-Methanolmischung gesättigte Kammer und lassen Sie die TLC laufen. Für den Lipidnachweis fügen Sie einige Jodgranulate in die frische Kammer hinzu und sättigen Sie die Kammer für fünf bis 10 Minuten. Platzieren Sie den TLC in der Kammer und beobachten Sie die Entwicklung gelber Flecken.
Für den Protein- und Kohlenhydratnachweis besprühen Sie die TLC-Platte mit Nicht-Wasserstoff oder Anisaldehyd und erhitzen Sie sie auf 110 Grad Celsius und beobachten Sie die Farbentwicklung. Für die NMR-Analyse stecken Sie das Rohr in den Schraubenschlüssel. Stellen Sie die Höhe des Rohrs mit einem angepassten Rohr ein.
Legen Sie die NMR-Röhre zusammen mit dem Schraubenschlüssel in ein MR-Gerät und befolgen Sie die im Papier genannten Schritte, um ein NMR-Spektrum zu erhalten. Für ein verbessertes Ölgewinnungsexperiment nehmen Sie eine Glassäule und versiegeln Sie den unteren Auslass mit Glaswolle und Glasperlen. Stützen Sie die Säule mit sandigem Boden so, dass etwas Flüssigkeit an der Oberseite des Bodens hinzugefügt werden kann.
Montieren Sie die Säule auf dem Halter und fügen Sie einige Glasperlen auf dem Boden hinzu. Überfluten Sie die Säule mit 50 Millilitern Solelösung und sammeln Sie den Durchfluss, um das schlechte Volumen zu bestimmen. Entfernen Sie die Sole von der Säule, indem Sie Rohöl zwingen, sie zu passieren.
Sammeln Sie das Volumen von Sole und Öl, das aus der Säule kommt, um das anfängliche Ölsättigungsvolumen zu bestimmen. Nach 24 Stunden überfluten Sie die Kolonne mit 10 schlechten Solevolumina und sammeln das Öl, das aus der Säule kommt, um die sekundäre Ölgewinnung zu schätzen. Das Öl, das nach der Sekundärölgewinnung in der Säule verbleibt, entspricht dem Restöl.
Bereiten Sie nun eine Mischung von Biotensiden vor, indem Sie das extrahierte Biotensid in ein Glasbecherglas geben. Geben Sie das Biotensid und die Mischung in die Säule und lassen Sie sie für die nächsten 24 Stunden ungestört. Messen Sie nach 24 Stunden die Menge an Öl und Wasser, die aus der Säule herausgespielt wurde, um eine zusätzliche oder verbesserte Ölgewinnung zu bestimmen.
Zellfreie Überstände der drei mikrobiellen Stämme wurden positiv auf das Vorhandensein von Biotensid bewertet, da sie zu Tropfenkollaps, Ölausbreitung und Emulsionsbildung führten. Die Bestätigung der Biotensidproduktion erfolgte durch Messung der Oberflächenspannung der zellfreien Brühe. Durch das Wachstum von Rhodococcus und Lysinibacillus reduzierte sich die Oberflächenspannung des Mediums von 59 auf 45 mN pro Meter.
Durch das Wachstum von Paenibacillus reduzierte sich die Oberflächenspannung des Mediums von 59 auf 28,4 mN pro Meter. Emulsionsstabilitätstests zeigten, dass die von den drei mikrobiellen Stämmen produzierten Biotenside unter verschiedenen Umweltbedingungen eine große Stabilität aufwiesen. Die Emulsionsindizes zeigten keine signifikante Veränderung, wenn die Inkubationstemperatur, der pH-Wert und die Salzkonzentration der zellfreien Brühe verändert wurden.
Die DLC-Charakterisierung des extrahierten Biotensids zeigte, dass Biotenside, die von allen drei Stämmen produziert wurden, Glykolip waren. Die chemische Identifizierung von Biotensiden zeigte, dass Rodococcus und Lysinbacillus das gleiche Biotensid produzierten, das als Rhamnolipid mit einer Masse von etwa vier 80 Dalton identifiziert wurde. Paenibaccilus hingegen produziert ein Rhamnolipid, das drei Lipidketten mit einer Masse von etwa 802 Dalton enthält.
Die Kombination von Biotensiden war in der Lage, 56,5% des Restöls aus der Sandsäule zurückzugewinnen. Die Biotensidproduktion aus den Stämmen von Rodococcus, Lsyinibaccilus und Paenibacillus wurde untersucht, und die Stämme wurden positiv für die Produktion von Biotensid bewertet. Die produzierten Biotenside wurden charakterisiert und als Rhamnolipide identifiziert.
Da die Biotensidkombination 56% des Restöls in einer Sandpackungstechnik zurückgewinnen konnte, kann die Biotensidkombination in Feldanwendungen verwendet werden, um das in den Ölreservoirs eingeschlossene Restöl zurückzugewinnen.
