この論文に記載されている研究は、カナダイノベーション自然科学工学研究評議会、サスカチュワン大学、サスカチュワン州政府、カナダ西部経済多様化カナダ、カナダ国立研究評議会、カナダ保健研究所の支援を受けたカナダ光源のBMIT施設で行われました。著者らは、カナダ光源、特にアダム・ウェッブ、デニス・ミラー、セルゲイ・ガシロフ、寧ズーのビームライン科学者に、SkyScan SRμCTと白いビーム顕微鏡システムのセットアップとトラブルシューティングに協力してくれたことに感謝したいと考えています。また、トレド医科生命科学大学のベス・ダルツェルと、オハイオ州北東部医科大学のジェフリー・ウェンストルップ博士に感謝したいと考えています。JMアンドロノフスキは、アクロン大学と国立司法科学法医学研究所が提供するスタートアップ研究資金(2018-DU-BX-0188)を通じて支援されています。RAデイビスは、アクロン大学が提供する大学院助手によってサポートされています。採点および鋸で使用される装置および供給は、アクロン大学とNSFが、CW HolyokeにEAR-1624242を交付するスタートアップ資金によって購入された。

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The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: <a target="_blank" href="https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf">https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf</a> (2017)</li><li>Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. 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著者らは開示するものは何もない。

限られたFOVセットアップで高解像度のSRμCTイメージング用の均一および円筒形皮質骨コアサンプルを調達するための包括的で標準化されたプロトコルはありませんでした。ここで詳述するプロトコルは、SRμCTイメージングのための一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法と、その後のマイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出に関する包括的なチュートリアルを提供することによって、その空隙を埋めます。我々のプロトコルは、任意の次元の直線的な骨ブロックを断面化する以前の記述よりも、皮質骨コアを調達するためのより標準化された信頼性の高い方法を提供することを示した。したがって、不規則な大きさの骨ブロックを除去するためにハンドヘルドロータリーツール(例えばDremel)に頼ってきた研究者は、イメージング中にサンプルセットアップ時間がはるかに長くなり、分析中の閾値および皮質毛穴抽出におけるより大きなエラーが発生した可能性が高い。この不一致は、骨サンプルの調製、その後の可視化と分析、および解釈結果に関するこの標準化されたプロトコルの必要性と重要性を強調しています。
ここで概説する手順は、生物人類学者や考古学者などの骨組織を一般的に評価する関連分野の研究者によってさらに適応される可能性があります。しかし、説明された研究プロトコルのために、糖尿病性も考古学的/歴史的骨標本も取り除かれなかった。ジアジェネシスは、地質学において、沈着後の物質(例えば、骨)の変化をいい、物理的、化学的、または生物学的手段29、30によって引き起こされる変化を包含し得る。地下水、真菌、および他の微生物浸潤は、いずれも、糖尿病の薬剤として作用し、骨組織の微小形態を変化させることができる。このような標本は、メチルメタクリレート(MMA)または2部エポキシ樹脂に埋め込むなど、スコアリングの前に追加の手順を必要とすることがあります。大腿骨ブロックを埋め込むのは、大腿皮質骨の密な性質と、死の直後に死体標本がエンバーミングされたという事実のために、記載された実験には必要ではなかった。ただし、壊れやすい骨格要素とその柱状子(例えば、肋骨)を評価する場合は、採点前に骨ブロック全体を埋め込むのがおすすめです。
この研究で評価されたすべての骨組織は、新鮮な間にエンバーミングされた。著者らは、エンバーミングプロセス中に使用される化学物質の特定の組み合わせにはアクセスできませんでしたが、保存化学物質にはホルムアルデヒド、エタノール、フェノール、エチレングリコール、グルタルアルデヒドが一般的です。ホルムアルデヒド飽和骨の微細構造の変化を記録した法医学人類学的データは限られているが、フライドランダー32はホルムアルデヒド固定が、Haversian運河および二次骨を含む特定の特徴の形態を変化させないことを実証した。しかしながら、ホルムアルデヒド飽和度は、衝撃強度および破壊靭性33,34のような非ヒト骨の特定の機械的特性および破壊特性に対する影響を文書化している。
高解像度X線システム(SRμCT)によるイメージングの前に皮質骨サンプルを採点する方法を報告しました。この方法は、材料や機器が地元のハードウェアストアから調達され、効率的であり、試料全体で均一なサンプルサイズを保証することができるという事実のために、費用対効果が高いです。既存の文献はまばらであり、準備とその後の分析に関する重要な詳細が欠けているため、SRμCTのサンプル調達、コーレート、分析方法に関する問い合わせを減らすことを期待しています。私たちの主な目標は、研究者がこの採点プロトコルを高解像度の骨イメージング研究のための標準化された手順として適用する動機付けすることです。さらに、この手法の開発において、前述の困難が、一般的な質問を緩和し、トラブルシューティングのガイダンスを提供することを期待しています。

近年のイメージング技術の進歩により、非常に高い解像度でX線イメージングデータを取得することが可能になりました。デスクトップマイクロCT(μCT)システムは、非破壊性の性質に起因する、消光骨を撮像するための現在の標準である1.しかし、皮質骨の微細構造特徴をイメージングする場合、μCTの使用はより限定的であった。解像度の制約により、デスクトップシステムは、骨細胞ラクナエのような皮質毛穴よりも小さい微細構造特徴を画像化するために必要な解像度を達成できません。このアプリケーションでは、SRμCTは、これらのシステムの解像度が高いため理想的です1.例えば、バイオメディカルイメージングおよび治療(BMIT)ビームライン2のカナダ光源(CLS)での実験では、ボクセルが0.9μmの小さな画像を生成しています。これまでの研究1、3、4、5は、この解像度を使用して、人間の長い骨(図1)からの皮質骨標本から投影とその後の3次元(3D)レンダリングを取得し、骨細胞ラクナー密度4、6、7、8、9およびヒトの寿命と男女間のラクナ形状とサイズ3の変動を定量化した。 さらなる研究は、ヒト10における骨バンディングの存在を実証しており、法医学人類学的文献において非ヒト哺乳類のみに関連付けられていると以前に認識されていた現象である。
例外的な解像度を達成するためには、X線ビームは、多くの場合、直径数ミリメートルに最大標本サイズを制限する視野(FOV)内に細かく焦点を合わせる必要があります。現在、これらの制限を満たす骨サンプル調達を概説する文献に記載されている包括的で標準化された手順はありません。FOV内のセンタリング標本は、1)イメージング中に180°回転する際にサンプルの中心を維持し、2)スキャンアーティファクトが画像切り捨てがないため制限されていることを確認するために重要です。つまり、FOVの外側のサンプルの部分は、FOV内の焦点に入るビームを妨げない。この場合、再構築アルゴリズムは完全に正しい再構築に必要な減衰データの一部を奪われます。360°(フル回転)スキャンはビーム硬化の影響を最小限に抑えますが、イメージング中の不整列やサンプルの動きによって引き起こされるアーティファクトを増加させることは注目に値します。したがって、360°スキャンは通常よりクリーンなデータを生成しますが、イメージング時間は2倍になり、実験コストとデータ品質の妥協に対処する必要があります。
骨イメージング実験の重要で見過ごされがちな側面は、スキャン前に行われる正確で複製可能な検体調製技術です。SRμCT法を実験に組み込んだ研究では、サンプリングプロトコルについて簡単に言及しているが、著者らは標本を収集するために使用される特定の方法論についてほとんどまたは全く詳細を提供していない。このような研究の多くは、任意の次元の直線的な骨ブロックを切断することを言及しているが、一般的に使用されるツールや埋め込み材料に関するそれ以上の情報を提供しない3,4,10, 11,12,13,14.一部の研究者は、一般的に、関心領域から骨の直線ブロックを除去するためにハンドヘルドロータリーツール(例えば、Dremel)を使用しています (ROI)3,4,10,11,12,13,14.この方法では、FOV より大きいサイズの不均等なサンプルが得られ、スキャンアーティファクトや画像切り捨ての可能性が高くなります。このような標本は、多くの場合、精密ダイヤモンドウェハソー(例えば、ビューラー異性体)を使用して、さらなる精製を必要とする。(200/mmまで)一貫した次元でサンプルを調達することは、取得したデータセットが最高品質で、その後の結果が複製可能であることを保証するために重要です。
サンプル調達方法論の限定的な報告は、以前の調査で実行された方法を採用および検証しようとする際に、困難の余分な層を追加します。現在、研究者は、サンプリング手順の詳細については、著者に直接連絡する必要があります。ここで詳述するプロトコルは、生物医学研究者に、徹底的に文書化され、複製可能で、コスト効率の高いサンプリング技術を提供します。この記事の主な目的は、マイクロアーキテクチャデータの正確な可視化と抽出のためにミルドリルプレスとダイヤモンドのスコアリングビットを使用して、一貫したサイズの皮質骨コアサンプルを調達する方法に関する包括的なチュートリアルを提供することです。この方法は、高圧岩力学15、16、17、18、19の硬質材料のブロックから均一な、小径(1-5ミリメートル)のシリンダーを日常的に収集するために使用される手順から変更されます。

<table><tbody><tr><td>1-1/8&quot; plunge cutting carbide for composites</td><td>Warrior</td><td>61812</td><td>28.6mm plunge</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP8201500</td><td>3.8 Liters</td></tr><tr><td>Blunt-tipped forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>55398</td><td></td></tr><tr><td>Crystalbond 509-3 Epoxy</td><td>Ted Pella</td><td>821-3</td><td></td></tr><tr><td>CTAnalyser</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.15.4.0</td><td>Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html</td></tr><tr><td>Dental Tool Kit</td><td>Amazon</td><td>787269885110</td><td></td></tr><tr><td>Diamond wafering saw blade for composite material</td><td>Buehler</td><td>#11-4247</td><td></td></tr><tr><td>Drill Press</td><td>Jet Mill/Drill</td><td>350017</td><td>Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem</td></tr><tr><td>Fine-tipped forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill</td><td>MSC Industrial Supply</td><td>#04804571</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>Ted Pella</td><td>26005</td><td>75x50mm slides, 1mm thick</td></tr><tr><td>Glass slide chuck</td><td>Buehler</td><td>#112488</td><td>Large enough to hold 75x50mm glass slides</td></tr><tr><td>Hot plate capable of reaching 140 &amp;deg;C</td><td>ThermoScientific</td><td>HP88850105</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NAPCO</td><td>Model 4200</td><td></td></tr><tr><td>Isocut Fluid</td><td>Buehler</td><td>111193032</td><td>Lubricant; 30mL</td></tr><tr><td>Jeweler&#039;s diamond coring drill bit</td><td>Otto Frei</td><td>#119.050</td><td>2mm inner diameter hollow stem coring bit</td></tr><tr><td>NRecon</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.6.10.2</td><td>Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html</td></tr><tr><td>Oscillating saw</td><td>Harbor Freight</td><td>62866</td><td></td></tr><tr><td>Oven-safe glass dishes</td><td>Pyrex</td><td>1117715</td><td>Glass food storage container</td></tr><tr><td>Precision slow-speed saw (Isomet 1000)</td><td>Buehler</td><td>111280160</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Amazon</td><td>25181</td><td></td></tr><tr><td>Shallow aluminum tins</td><td>Amazon</td><td>B01MRWLD0R</td><td>~8cm diameter</td></tr><tr><td>Specimen cups</td><td>Amazon</td><td>616784425436 885334344729</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme detergent</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>1.8kg box</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>MTI Corporation</td><td>KJ201508006</td><td></td></tr></tbody></table>

a sectioning, coring, and image processing guide for high-throughput cortical bone sample procurement and analysis for synchrotron micro-ct

骨は、人間の寿命にわたって構造を変化させる動的で機械的に活性な組織です。骨のリモデリングプロセスの産物は、従来の二次元技術を用いて実質的に研究されてきた。デスクトップマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)およびシンクロトロン放射微小断層撮影(SRμCT)によるX線イメージング技術の最近の進歩により、他の3Dイメージング技術(例えば、SEM)よりも大きな視野(FOV)の高解像度3次元(3D)スキャンを取得することができました。ただし、データ分析に影響を与えるストリークアーティファクトの外観を制限するために、標本はFOV内で正確に中心に配置する必要があります。これまでの研究では、不規則な形状の直線的な骨ブロックの調達が報告され、エッジの不均一や画像切り捨てによるイメージングアーティファクトが発生しています。ヒトの女性の前側面からSRμCT実験用に一貫して大きさの皮質骨コア標本を調達するために、地質サンプリングプロトコル(スコア)を適用しました。このスコアリング方法は、効率的で、組織に対して最小限の破壊です。回転中に等角体であること、および走査中のX線ビームに均一なパス長を提供する性質によって、イメージングアーティファクトを減少させる均一な円筒形サンプルを作成します。X線の断層データの成形および不規則な形状のサンプルの画像処理は、皮質骨マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する技術の可能性を確認する。このプロトコルの目標は、さまざまなタイプの高解像度骨イメージング実験に適応可能な皮質骨コアの抽出のための信頼性と再現性のある方法を提供することです。この作業の包括的な目標は、手頃な価格で一貫性があり、簡単なSRμCTの標準化された皮質骨調達を作成することです。この手順は、生物人類学、地球科学、材料科学などの硬質複合材料を一般的に評価する関連分野の研究者によってさらに適応され得る。

コアサンプリングの記載された方法は、非常に効果的かつ効率的であることが判明しました。このプロトコルを使用した試料の採点は、1.49 μmボクセルサイズで約2mmのFOVを有するCLS BMIT-BMビームライン2での実験用に、一貫してサイズのサンプルを>300の調達に可能にした。コア直径の一貫性を検証するために、人間の前大腿心のサブセットの長さ(上、中央、下)に沿って3つの測定値を測定しました(n=69)。コアの平均直径は1.96±0.11mmで、コアの長さに沿った平均薄化は0.06±0.06mm/mm他の硬質複合材料への適用性を強調するために、この方法をドロマイト(n=32)のサンプルに対して試みたため、平均直径は1.06±0.02mmでした。コアサンプルの長さに沿って間引きは0.01±0.005 mm/mmとして記録されました。ステップ4.2.3で説明したように、硬化した試料とロータリーツールを用いて調達した1本(例えば、ドレメル)の画像処理ワークフローを比較した代表的な図は、図7に示すことができる。一般的な回転ツールを使用したサンプルカットでは、カナル(Ca.N)とラクナエ(Lc.N)の数が増加し、平均運河径(Ca.Dm)、運河容積(Ca.V)、皮質孔質(Ca.V/TV)がコードサンプルと比較して減少しました。これらの違いの一部は、個人間の骨の微細構造の変動が原因である可能性がありますが、回転ツールデータセットから抽出された運河およびラクナエの数が多いほど、スキャンアーティファクトとノイズのために人工的に増加した可能性があります(図7)。各サンプルのステップ 4.2.3.9 から収集された空隙率データは、表 1にあります。この採点プロトコルはSRμCTスキャンで観察されたアーチファクトを減少させるが、直流骨ブロック実験(図7A)の低品質の人工物を含む数値は多面的な問題を表していることは注目に値する。特定のアーティファクト(例えば、位相コントラスト信号)は、シンクロトロン施設またはビームライン特有の問題によって引き起こされた可能性があります。実験の代表的なセットと関連する図(図7A、7B)の両方のスキャンパラメータは、補足材料(表S1、S2)にあります。
上記に示すように、コレクトされたサンプルから収集されたシンクロトロンマイクロCT画像は、ストリークアーティファクトを含むスキャンアーティファクトを正常に抑制しました。その後の画像処理は、皮質骨マイクロアーキテクチャの可視化を改善する技術の可能性を確認した。例えば、鉱化の違い、骨界境界の改善された線引き、および血管管内の軟組織の一貫した視覚化が観察された(図8C、8D)。後者は、細孔が完全に満たされていないので、運河内の軟組織の部分的な視覚化が、気孔率と孔厚の不正確な計算をもたらす可能性があるため、画像処理にとって重要である。骨細胞ラクナエの境界も複屈折の減少により改善され、形状パラメータの定量化が可能であった。記載されたスコアリング技術の潜在的な利点は、FOVに標本を中心にする容易さ、分析要件の低下、および血管管内の軟組織の一貫した視覚化を含む。
同様の手順は、高圧岩変形実験のためのオルトピロキセン18、多結晶マグネサイト19および他の地質材料15、16、17のコア単結晶にうまく使用されています。これらの実験では、配向特異的強度を決定するために、単結晶18の結晶学的軸に対して特定の向きのコアが必要、または多結晶岩19の結晶に整列する。上述のアプローチは、最初に指向スラブを作成し、その後、一連の変形実験のために複数の均一な円筒形コアを収集するために使用されてきました。これらの方法は、骨、セラミックス、ガラスなどの硬質材料のコアを収集するために使用することができます。例えば、上記の方法論は、皮質骨内の特定の領域および関連する生体力学的(例えば、張力/圧縮)軸からのコアを評価するために生物人類学者によって適用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig1v2.jpg"> 図 1.左前前から円筒形VOIヒト中シャフト大腿骨。 左前前のヒト中軸大腿骨(21歳の女性)(A)からコア全体の単一のSRμCT再構成されたスライス(A)と、上面(B)と前方のビュー(C)からの円筒形VOIの3Dレンダリングが可視化される。投影は0.9 μmで撮影され、血管管は赤で、骨細胞ラクナエは灰色で強調された。スケール バーは 0.25 mm (A) と 0.02 mm (B,C) を示します。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig2.jpg"> 図 2.中軸の大腿試料(厚さ5mm)を熱エポキシ(材料表参照)でガラス顕微鏡スライドに取り付け、ガラススライドチャックに固定した。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig3.jpg"> 図 3.取り付けられた標本が付いたガラススライドチャックは、断面化前に低速断面鋸(材料表を参照)の旋回アームに固定されています。 鋸刃に対する回転腕の横位置と断面速度(RPM)は、LCDディスプレイの上下の列にそれぞれ表示されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig4.jpg"> 図 4.アルミニウムスズに取り付けられた5mmの大腿部は、コーリングに備えて固定クランプを使用してXYミルドリルプレス機テーブルに固定されています。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig5.jpg"> 図 5.工夫されたプロトコル(A)に採用されているミルドリルプレス。矢印は深度リミッターを識別し、ドリルビットがサンプルに深く浸透したり、スズの底部(B)を通り抜けないようにします。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig6.jpg"> 図 6.前側面からの中心調達後の5mm大腿骨の断面。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig7v2.jpg"> 図 7.単一SRμCTは、2人の個体から左大腿骨の前側面のスライスを再構築した。標本(A)を共通の回転工具を用いて切片し、ここで説明した採点方法を用いて(B)調達した。各スライスは、セグメント化された対応する(C と D) と比較されます。回転工具(C)で採取した試料とは対照的に、芯付き試料(D)中の皮質孔隙間を単離し易さに注意してください。これは、各サンプルの血管管の3Dレンダリング(EおよびF)でさらに証明される。Bの周囲の騒音は明らかであり、標本はFOVを離れ、画像処理中の課題が増加する。パネルのスケールバー(D)は、パネル用の250 μm(A-D)を示します。パネルのスケールバー(EとF)はそれぞれ700と600μmを示します。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig7v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61081/61081fig8v2.jpg"> 図 8.ロータリーツール(A-C)で調達したサンプルからの代表的なROIと、ここで示す方法(D-F)を使用して1つのコーレド。 パネル (A) および (D) は、SRμCT スキャンからの指定された ROI を表します。パネル(B)および(E)は、血管管パラメータを分離して抽出するために使用される処理段階を表す。パネルの右上(B)には、画像処理ソフトウェアによって血管管に分類された無関係な物体(矢印)があります。パネル(C)と(F)は、ラクナエを分離して抽出するために使用される処理段階を表します。スケール バーは、すべてのパネルの 0.1 mm を表します。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/61081fig8v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ティッシュボリューム(テレビ)</td>
			<td>運河容積(Ca.V)</td>
			<td>カナルサーフェス(Ca.S)</td>
			<td>皮質多孔性(Ca.V/TV)</td>
			<td>運河表面から組織への体積(Ca.S/TV)</td>
			<td>平均運河径 (Ca.Dm)</td>
			<td>平均運河分離 (Ca.Sp)</td>
			<td>いいえ。運河の中で</td>
			<td>いいえ。ラクナエ(Lc.N)の</td>
			<td>細孔密度(毛穴/テレビ)</td>
		</tr>
<tr>
<td>単位</td>
			<td>mm³</td>
			<td>mm³</td>
			<td>mm²</td>
			<td>%</td>
			<td>1/mm</td>
			<td>Μ m</td>
			<td>Μ m</td>
			<td>#</td>
			<td>#</td>
			<td>毛穴/μm³</td>
		</tr>
<tr>
<td>ロータリーカット</td>
			<td>0.15861</td>
			<td>0.01780</td>
			<td>0.00287</td>
			<td>11.23</td>
			<td>0.01808</td>
			<td>51.05</td>
			<td>122.81</td>
			<td>459</td>
			<td>64662</td>
			<td>0.00041</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラード (このメソッド)</td>
			<td>0.15747</td>
			<td>0.02451</td>
			<td>0.00216</td>
			<td>15.56</td>
			<td>0.01373</td>
			<td>120.73</td>
			<td>145.38</td>
			<td>76</td>
			<td>30531</td>
			<td>0.00019</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.回転工具および芯付き試料のステップ4.2.3.9の代表的な結果を 図8に可視化。減少したCa.V、Ca.V /TV、Ca.Dm、ロータリーカットサンプルの細孔および細孔密度の数だけでなく、血管管およびラクナエの数の増加に注意してください。不均一に切断されたサンプルによって部分的に誘発されたスキャンアーティファクトは、ラクナおよび皮質毛孔の人工的な増加に寄与した可能性が高い。
補足材料。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61081/Andronowski_et_al._Supplementary_Materials.docx" target="_blank">これらの資料をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。

高スループットコルティカル骨サンプルの採取と分析のための断面化、スコアリング、画像処理ガイド

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

5.0K ビュー.  The University of Akron. ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

生物工学

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

発生生物学

Outer-Boundary Assisted Segmentation and Quantification of Trabecular Bones by an Imagej Plugin

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different bone loss conditions. However, the standard approach for trabecular analysis of micro-CT images is slice-by-slice semi-automatic hand-contouring, which is labor intensive and error prone. Described here is an efficient method for automatic segmentation of trabecular bones according to the bone's outer boundaries, where trabecular bones can be identified and segmented automatically with accuracy with less operator bias when appropriate segmentation parameters are set. To profile satisfactory segmentation parameters, an image stack of segmentation results is displayed, where all possible combinations of the segmentation parameters are changed one by one in sequence, and segmentation results with associated parameters can easily be visually checked. As a quality-control feature of the plugin, simulated standard objects are quantified where the measured quantities can be compared with theoretical values. Layer-by-layer quantification of trabecular properties and trabecular thicknesses are reported by such a plugin, and the distributions of such properties within the selected regions can be profiled easily. Although layer-by-layer quantification retains more information about trabecular bones and facilitates further statistical analysis of structural changes, such measures are unavailable from the output of current commercial software, where only a single quantified value for each parameter is reported for each sample. Therefore, the described workflows are better approaches for analyzing trabecular bones with accuracy and efficiency.

We present a workflow for segmenting and quantifying trabecular bones for 2D and 3D images based on the bone&#39;s outer boundary using an ImageJ plugin. This approach is more efficient and accurate than the current manual hand-contouring approach, and provides layer-by-layer quantifications, which are not available in current commercial software.

外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different ...

3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described protocol is easy to apply, fast and suitable for larger soft-tissue samples. The presented methodology enables the characterization of crucial tissue structures in three dimensions and is demonstrated on a whole mouse kidney. The multiscale approach allows to image the entire mouse kidney and supports the selection of further volumes of interest, which are acquired with higher resolutions ranging into the nanometer range. Thereby, soft-tissue morphology with a similar detail level as the corresponding histological light microscopy images is reproduced. Deeper insights into the 3D configuration of tissue structures are achieved without impeding further investigations through histological methods.

A protocol for 3D visualization of microscopic tissue structures by using an X-ray specific staining method designed for X-ray computed tomography is presented.

X線特異的染色法とナノスコピックコンピュータ断層撮影法を用いた軟組織試料の3次元イメージング

We demonstrate a laboratory-based method combining X-ray microCT and nanoCT with a specific X-ray stain, which targets the cell cytoplasm. The described ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

神経科学

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

骨折感受性のための機械的試験の原理とプロトコル

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

著者スポットライト:全骨曲げ試験における精度と再現性の向上 

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

げっ歯類の骨の全骨曲げ試験を含む研究の設計、実施、および解釈に関する実践的な考慮事項

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

マウス新生児脳マイクロCTスキャンと画像処理

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

著者スポットライト:マウス新生児の脳の高解像度イメージング – ルゴール溶液造影剤によるマイクロCTプロトコル

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

マウス新生児脳のマイクロCTイメージングと形態解析

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造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

X線特異的染色法とナノスコピックコンピュータ断層撮影法を用いた軟組織試料の3次元イメージング

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

神経科学の TEM セクションをサンプリングの公平なアプローチ

げっ歯類の骨の全骨曲げ試験を含む研究の設計、実施、および解釈に関する実践的な考慮事項

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マウス新生児脳のマイクロCTイメージングと形態解析