細胞や組織の生体力学的性質は、その機能と活力を調節します。AFMは、弾性測定に基づいて、変形性関節症を細胞レベルで早期に定量化することができます。AFMは、サンプルを損傷することなく、高分解能、信頼性、感度を備えた、セルラーレベルでの測定の取得を可能にします。
バイオメカニカルな性質の変化は、変形性関節症の初期に起こります。関節軟骨の局所弾性を測定することで、局所組織変性の程度について有効な結論を導き出すことができます。ヒト膝関節内の変性変化を評価するには、まずメスを使用して軟骨の下骨から関節軟骨全体を切断し、クライオトーム装置の低温下で凍結するクライオトームノブに軟骨サンプルを水溶性の埋め込み培地に埋め込みます。
サンプルが凍結したら、標準的なCryotomeを使用して、関節軟骨の最上層から35マイクロメートルの厚い組織のセクションを取得し、各セクションを個々のガラススライドに集めます。すべての切片が得られたら、新鮮なPBSで1洗浄につき5分間サンプルを3回リンスし、水溶性埋め込み培地を除去する。最初のスライドを洗い物から取り出します。
この後、個々のAFM互換ペトリ皿にセクションごとに2〜3滴の生体適合性サンプル接着剤を追加します。サンプルから余分な溶液を取り除き、乾燥したセクションの端を接着剤の斑点に静かに押し込みます。2分後、L-グルタミンを含まないライボヴィッツのL-15培地で結合した組織を慎重に覆い、サンプルが分析されるまで細胞培養インキュベーターに皿を入れます。
AFM装置を準備するために、AFMホルダーの液体環境で測定するガスブロックを上面がホルダーに平行になるように調整し、ピンセットを使用して、選択した片持ちを慎重にガラスブロックの表面に取り付け、微小球を有するAFM先端が研磨された光学面の上に突き出るようにします。ガラスブロックの片持ちレバーを安定させるために、金属スプリングをブロックの溝にスライドさせ、ピンセットを使用してカンチレバーの上部をスプリングでクランプします。ガラスブロックをAFMヘッドに慎重に置き、統合されたロック機構でブロックを固定します。
次に、AFMヘッドをカンチレバーでAFMデバイスに取り付け、スプリングを左に向けます。サンプルをAFMデバイスに取り付けるには、サンプルペトリ皿をAFMサンプルホルダーに置き、ペトリ皿ヒーターを摂氏37度に設定します。約20分後、デバイスソフトウェアとレーザーアライメントを開き、パラメータ設定のウィンドウを設定します。
次に、ステッパーモーター、レーザー光、およびCCDカメラをオンにし、ステッパーモータ機能を使用して、片持ちレバーが媒体に完全に沈むまで100マイクロメートルのステップで片持ち体を下げます。調整ネジを使用して、レーザーを片持ちレバーの上に向け、AFMデバイスのネジを使用して、反射されたビームが光検出器の中心に落ちるようにレーザービームを調整します。レーザー片持ち面を調整したら、必要に応じて光検出器を調整して、合計信号を1ボルト以上に設定し、横方向および垂直偏向をゼロに近づけます。
キャリブレーション力曲線を取得するには、表に示されているアプローチパラメータを使用してスキャナアプローチを実行します。組織培養皿の底部に達したら、片持ち面を100マイクロメートルだけ引き込みます。表に示すように、実行パラメーターを設定します。
そして、測定を開始し、キャリブレーション力距離曲線を取得するために実行をクリックします。力曲線は図に示すように得られる。キャリブレーション力の距離カーブで、リトラクトカーブの線形フィットの領域を選択します。
線形フィットが配置されると、値はソフトウェアによって保存されます。次に、測定が摂氏37度の温度で媒体で行われるように、ソフトウェア内の温度変数を37度に設定して、生理学的条件を可能な限り近づけます。軟骨サンプル切片の収束パターンを同定するために、骨関節炎の膝から関節軟骨の特定の細胞パターンを見つけて同定し、これは健康な組織領域を示す単一の文字列、組織変性の始まりを示す二重の糸、進行した組織変性の徴候である小さなクラスター、および大きなクラスターを含む可能性がある
特定の所望のパターンが特定されると、細胞内マトリックス測定のために、細胞に近接して片持ち体を配置し、マトリックスタイプごとに選択されたパターンごとに2つの部位を測定し、測定部位あたり9回、可能な不正確さを考慮するのに十分な大きさのサンプルサイズを含む。測定するパターンのセルラーマトリックスに焦点を当て、その時点でコンピュータマウスを固定します。次に、プローブに焦点を合わせ、プローブの先端をコンピュータの矢印で以前に固定された位置に移動します。
細胞外マトリックスの測定を行うために、細胞のない領域を選択し、カンチレバーが組織の上に100マイクロメートル配置されるように引き込むアプローチを実行する。次に、カンチレバーのキャリブレーションで得られた設定点パラメータを使用して、測定を開始するために実行をクリックします。取得したデータを処理するために、AFM装置から得られたデータと互換性のあるデータ処理ソフトウェアを開き、力距離曲線を処理するためのソフトウェアでHearstモデルを選択する。
ポアソン比を 0.5 に、先端シェイプを球形に、先端半径を 12.5 マイクロメートルに設定します。すべてのパラメータが調整されると、結果が適合され、ヤング率がソフトウェアによって計算されます。弦から二重弦、小さなクラスターから大きなクラスターまでの物理病理学的モデルに沿って、細胞外および細胞内マトリックスの弾性率は、文字列と二重弦の間を除いて、各パターン変化の間で有意に減少します。
また、細胞外細胞間マトリックス比は大きく変化せず、細胞外マトリックスと細胞内マトリックスとの間の弾力性の絶対的な差が顕著に減少することは観察される。弾性値は、インデント深さや片持ち辺の先端のプロパティなど、さまざまな条件に依存します。AFMは、同じ実験セットアップ内で異なる条件を比較するのに最適です。
AFMはサンプルの局所弾性を測定するので、正確な測定を可能にし、カンチレバーの損傷を避けるためにセクションを固定する必要があります。組織の弾性変化を担うプロセスをさらに分析するために、対象となるタンパク質の構造の生化学的定量は、ウェスタンブロットまたはエリサを介して行うことができる。
