Die biomechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren ihre Funktion und Vitalität. AFM ermöglicht die frühe Quantifizierung von Arthrose auf zellulärer Ebene basierend auf Elastizitätsmessungen. AFM ermöglicht die Erfassung von Messungen auf zellulärer Ebene, ohne die Probe zu beschädigen und mit einer hohen Auflösung, Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit.
Biomechanische Eigenschaftsänderungen treten früh bei Arthrose auf. Die Messung der lokalen Elastizität des Gelenkknorpels ermöglicht es, stichhaltige Rückschlüsse auf den Grad der lokalen Gewebedegeneration zu ziehen. Um degenerative Veränderungen innerhalb des menschlichen Kniegelenks zu bewerten, verwenden Sie zunächst ein Skalpell, um den Gelenkknorpel als Ganzes aus dem subchondralen Knochen zu schneiden und die Knorpelprobe in ein wasserlösliches Einbettmedium auf dem Cryotome-Knopf einzubetten, der bei niedriger Temperatur im Cryotome-Gerät gefriert.
Wenn die Probe eingefroren ist, verwenden Sie ein Standard-Kryotome, um einen 35 Mikrometer dicken Gewebeabschnitt aus der obersten Schicht des Gelenkknorpels zu erfassen und jeden Abschnitt auf einzelne Glasschlitten zu sammeln. Wenn alle Abschnitte erhalten sind, spülen Sie die Proben dreimal in frischem PBS für fünf Minuten pro Wäsche, um das wasserlösliche Einbettmedium zu entfernen. Entfernen Sie die erste Folie aus der Wäsche.
Danach zwei bis drei Tropfen biokompatiblen Probenkleber pro Abschnitt in einzelne AFM-kompatible Petrischalen geben. Entfernen Sie überschüssige Lösung aus der Probe und drücken Sie vorsichtig die Ränder des getrockneten Abschnitts auf die Klebeflecken. Nach zwei Minuten die geklebten Gewebe ohne L-Glutamin vorsichtig mit Leibovitz' L-15-Medium bedecken und die Gerichte in einen Zellkultur-Inkubator legen, bis die Proben analysiert werden sollen.
Um das AFM-Gerät vorzubereiten, stellen Sie einen Gasblock für die Messung in einer flüssigen Umgebung auf dem AFM-Halter so ein, dass die obere Oberfläche parallel zum Halter ist, und verwenden Sie eine Pinzette, um den ausgewählten Ausleger sorgfältig auf die Oberfläche des Glasblocks zu montieren, so dass die AFM-Spitze mit der Mikrosphäre über die polierte optische Ebene ragt. Um den Ausleger auf dem Glasblock zu stabilisieren, schieben Sie die metallische Feder in die Nut des Blocks, und verwenden Sie eine Pinzette, um die Oberseite des Auslegers mit der Feder zu klemmen. Stellen Sie den Glasstein mit dem Ausleger vorsichtig auf den AFM-Kopf und sichern Sie ihn mit dem integrierten Verriegelungsmechanismus.
Dann montieren Sie den AFM-Kopf mit dem Ausleger auf das AFM-Gerät mit der Feder nach links. Um die Probe auf das AFM-Gerät zu montieren, legen Sie die Probe Petrischale auf den AFM-Probenhalter und stellen Sie die Petrischale auf 37 Grad Celsius. Öffnen Sie nach ca. 20 Minuten die Gerätesoftware und die Laserausrichtung und nähern Sie parametereinstellungsfenster an.
Schalten Sie als Nächstes den Schrittmotor, das Laserlicht und die CCD-Kamera ein und verwenden Sie die Schrittmotorfunktion, um den Ausleger in 100 Mikrometer-Schritten zu senken, bis der Ausleger vollständig in das Medium getaucht ist. Verwenden Sie die Einstellschrauben, um den Laser auf die Oberseite des Auslegers zu richten, und verwenden Sie die AFM-Geräteschrauben, um den Laserstrahl so einzustellen, dass der reflektierte Strahl auf die Mitte des Photodetektors fällt. Sobald der Laserausleger eingestellt wurde, stellen Sie den Photodetektor nach Bedarf ein, um das Summensignal auf einen Volt oder höher und die seitlichen und vertikalen Verformungen nahe Null einzustellen.
Um die Kalibrierkraftkurve zu erhalten, führen Sie einen Scanneransatz mit den in der Tabelle angegebenen Anflugparametern aus. Sobald der Boden der Gewebekulturschale erreicht ist, ziehen Sie den Ausleger um 100 Mikrometer zurück. Richten Sie die Ausführungsparameter ein, wie in der Tabelle angegeben.
Und klicken Sie auf Ausführen, um eine Messung zu starten und eine Kalibrierkraftentfernungskurve zu erhalten. Die Kraftkurve wird wie in der Abbildung dargestellt ermittelt. Wählen Sie in der Abstandskurve der Kalibrierkraft den Bereich für eine lineare Anpassung der eingefahrenen Kurve aus.
Sobald die lineare Passung vorhanden ist, werden die Werte von der Software gespeichert. Wenn die Messungen dann in Mittelbei 37 Grad Celsius durchgeführt werden, stellen Sie die Temperaturvariable in der Software auf 37 Grad ein, um die physiologischen Bedingungen so genau wie möglich nachzuahmen. Um die Konversitenmuster in den Knorpelprobenabschnitten zu identifizieren, lokalisieren und identifizieren Sie die spezifischen zellulären Muster des Gelenkknorpels aus dem osteoarthritischen Knie auf dem Phasenkontrastmikroskop, das einzelne Saiten enthalten kann, die auf gesunde Gewebebereiche hinweisen, Doppelsaiten, die auf den Beginn der Gewebedegeneration hinweisen, kleine Cluster, die Anzeichen einer fortgeschrittenen Gewebedegeneration sind, und große Cluster, die auf eine Gewebezerstörung im Endstadium hinweisen.
Sobald ein bestimmtes gewünschtes Muster identifiziert wurde, positionieren Sie den Ausleger bei perizellulären Matrixmessungen in unmittelbarer Nähe zu den Zellen und messen zwei Standorte pro gewähltem Muster pro Matrixtyp, neunmal pro Messstelle, einschließlich einer Stichprobengröße, die groß genug ist, um mögliche Ungenauigkeiten zu berücksichtigen. Konzentrieren Sie sich auf die zelluläre Matrix des zu messenden Musters und fixieren Sie die Computermaus an diesem Punkt. Konzentrieren Sie sich anschließend auf die Sonde, und bewegen Sie die Spitze der Sonde auf den Punkt, der zuvor durch den Computerpfeil festgelegt wurde.
Um Messungen der extrazellulären Matrix durchzuführen, wählen Sie einen Bereich ohne Zellen aus und führen sie einen Ansatz durch, gefolgt von einem Rückzug, so dass der Ausleger 100 Mikrometer über dem Gewebe positioniert ist. Klicken Sie dann auf Ausführen, um die Messungen zu starten, indem Sie den Sollwertparameter verwenden, der durch Kalibrierung des Auslegers erhalten wurde. Um die erhaltenen Daten zu verarbeiten, öffnen Sie eine Datenverarbeitungssoftware, die mit den vom AFM-Gerät erhaltenen Daten kompatibel ist, und wählen Sie in der Software das Hearst-Modell für die Verarbeitung der Kraftentfernungskurven aus.
Legen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,5, die Spitzenform als kugelförmig und den Spitzenradius auf 12,5 Mikrometer fest. Sobald alle Parameter angepasst wurden, werden die Ergebnisse angepasst und der Young es Modulus wird von der Software berechnet. Entlang des physiopathologischen Modells von Saiten zu Doppelsaiten und von kleinen zu großen Clustern nehmen sowohl extrazelluläre als auch perizelluläre Matrix-Elastikmodule zwischen jeder Musteränderung signifikant ab, außer zwischen Strings und Doppelsaiten.
Darüber hinaus ändert sich das extrazelluläre-perizelläre Matrixverhältnis nicht signifikant, während eine deutliche Abnahme der absoluten Unterschiede in der Elastizität zwischen den extrazellulären und perizellulären Matrizen beobachtet wird. Elastizitätswerte hängen von verschiedenen Bedingungen ab, z. B. der Einzugstiefe oder den Auslegerspitzeneigenschaften. AFM eignet sich daher am besten für den Vergleich verschiedener Bedingungen innerhalb desselben Versuchsaufbaus.
Da der AFM die lokale Elastizität der Probe misst, müssen die Abschnitte fixiert werden, um präzise Messungen zu ermöglichen und Auslegerschäden zu vermeiden. Um die Prozesse, die für Gewebeelastizitätsänderungen verantwortlich sind, weiter zu analysieren, kann die biochemische Quantifizierung der Struktur von Proteinen von Interesse über westliche Flecken oder ELISAs durchgeführt werden.
