アシル樹脂アシストキャプチャまたはアシルRACは、様々な生物学的サンプルでプロテインS-アシル化を検出するために使用できる敏感で信頼性の高い方法です。このプロトコルは、代謝標識とラジオ標識の制限の一部をバイパスし、複数のタンパク質のS-acylationの同時検出を可能にします。生細胞だけでなく、一次組織や凍結サンプルも。
S-acylationは、タンパク質の密売、血漿膜ターゲティング、シグナル伝達、鉄輸送、タンパク質-タンパク質相互作用など、さまざまな細胞プロセスを調節することができます。チオスター結合の効率的かつ特異的な切断を確実にするために、各実験に対して慎重に調整されたpHで作りたてのヒドロキシルアミン溶液を使用することが重要です。この方法のデモンストレーションでは、クロロホルム、メタノール沈殿のようなステップのために重要です。
このステップの間に得られるパンケーキの形のペレットは非常に注意深く扱うべきである。それは、工程中にサンプルの壊れやすいおよび部分的な損失であり、不均一なサンプル回復につながる可能性があります。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるサバンナ・ウェストです。
細胞ライセートを得るために、目的の細胞を円錐形遠心分離管に集める。遠心分離により細胞の破片を除去します。ペレットをPBSの5ミリリットルで洗います。
そして、すぐに作りたてのリシスバッファーの600マイクロリットルで細胞を再懸濁します。サーモシェーカーで1分あたり1,500回転でサンプルを4°Cで30分間攪拌します。溶解物をクリアする前に、ペレット洗剤および可溶性物質を遠心分離によって。
遠心分離の終わりに、氷の上に予冷した1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にクリアしたライセートを集める。そして、ブラッドフォードまたはビチンチオニン酸アッセイを実行して、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を推定する。メタノールとクロロホルムを加えて、2:1の比率でライセートします。
均質な懸濁液を作成し、サンプルを遠心分離して、水相と有機相の界面でタンパク質ペレットを収集するために厳密に振ります。チューブを傾け、できるだけ多くの溶媒を吸引するために針またはゲルローディングチップを使用してください。空気は、数分間、タンパク質ペレットを乾燥させます。
600マイクロリットルのメタノールでチューブ内容物を軽く混合する前に、ペレットを分解しないように注意してください。メタノール洗浄を慎重に除去した後、ベンチトップのプロテインペレットを約5分間乾燥させます。次に、2SHBバッファーの200マイクロリットルでタンパク質ペレットを再懸濁する。
そして、サーモシェーカーで摂氏42度と毎分1、500回転で渦。ペレットが溶解したら、2SHBに0.2%MMTSの200マイクロリットルをサンプルに加えます。そして、熱シェーカーで摂氏42度で15分間、毎分1,500回転をインキュベートします。
インキュベーションの終わりに、実例のように3:4クロロホルムメタノール沈殿を行う。MMTSを除去するには、ペレットをボルテックスで新鮮な2SHBバッファーの100マイクロリットルに溶解します。そして、各沈殿後に300マイクロリットルのバッファーAでサンプルを希釈する。
最終的な沈殿後、2SHBバッファーの200マイクロリットルにサンプルを溶解し、240マイクロリットルのバッファーAで希釈し、タンパク質濃度を再び測定し、各サンプルから40マイクロリットルを入力コントロールとして確保します。サンプルを200マイクロリットルの2つの等しい量に分割します。そして、プラスヒドロキシラミンとマイナスヒドロキシラミンとしてチューブをマークします。
プラスヒドロキシルアミンチューブに400ミリモルの最終濃度に作りたての中性2モルヒドロキシラミンの50マイクロリットルを追加します。そして50マイクロリットルの中性2モル塩化ナトリウムを負の対照に、マイナスヒドロキシルアミンチューブとした。その後、各チューブに30マイクロリットルのTSビーズスラリーを加えます。
そして、室温で1〜2時間チューブを回転させます。インキュベーションの終わりに、ビーズをバッファーAに1%SDSで4回洗浄し、残留ヒドロキシルアミンを除去します。最後の洗浄後、3つの穏やかな1分間のマイクロ遠心ですべてのビーズサンプルを洗います。
慎重に上清を吸引し、各洗浄時にバッファーAの1%SDSの500マイクロリットルでビーズを再懸濁する。最後の洗浄後、実演したようにビーズをそっと回転させます。そして、ビーズを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を吸引します。
ビーズからタンパク質を回収するには、各チューブに4%SDSサンプルバッファーの50マイクロリットルを加え、サーモシェーカーで15分間、摂氏80度、1分あたり1,500回転でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを冷やしてから遠心分離機を放ち、ビーズを完全にペレットにします。次に、ゲルローディングチップを使用して、溶出したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。
そして、SDS-PAGEゲルでサンプルを実行して、ウェスタンブロッティングによる目的のタンパク質のS-アシル化を分析します。チロシンキナーゼLckは、中性2モルヒドロキシルアミンで処理されるライセートで検出することができる。システイン残基と脂肪酸部分との間のチオスター結合を切断する。
FynおよびLATタンパク質に対する抗体によるストリッピングと再確認は、アシル樹脂支援捕捉アッセイを使用して、複数のタンパク質のS-acylationを同時に分析できることを実証しています。さらに、Lck、Fyn、およびLATのS-アシル化は、一次マウスの脾細胞において容易に検出することができる。この修飾が2種間で保存されていることを示す。
新しいS-acylatedタンパク質の同定に加えて、この方法は、異なる生物学的条件下でのタンパク質S-アシル化の変化を評価するためにも使用することができる。新たに同定されたS-acylatedタンパク質の数は、ダブルアップがAcyl-RACのような高速で信頼性の高い技術を意味した後、大幅に増加しました。新しいS-acylatedタンパク質の同定に加えて、この方法は、異なる生物学的条件下でのタンパク質S-アシル化の変化を評価するためにも使用することができる。
