Acyl-resin בסיוע לכידה או Acyl-RAC היא שיטה רגישה ואמינה שניתן להשתמש בה כדי לזהות S-acylation חלבון במגוון של דגימות ביולוגיות. פרוטוקול זה עוקף חלק מהמגבלות של תיוג מטבולי ותיוג רדיו, ומאפשר זיהוי בו זמני של S-acylation של חלבונים מרובים. לא רק תאים חיים אלא גם רקמות ראשוניות ודגימות קפואות.
S-acylation יכול לווסת מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון סחר בחלבון, מיקוד קרום פלזמה, העברת אותות, הובלת ברזל, אינטראקציות חלבון חלבון. חשוב להשתמש בתתכונת הידרוקסילאמין טרי עם pH מותאם בקפידה עבור כל ניסוי כדי להבטיח מחשוף יעיל וסופקסי של הקשר thioester. עם הדגמה של שיטה זו זה קריטי עבור צעדים כמו כלורופורם, משקעים מתנול.
גלולת צורת פנקייק שהושגו במהלך שלב זה צריך להיות להתמודד בזהירות רבה. זה יכול להיות שביר ואובדן חלקי של המדגם במהלך השלב יכול להוביל להתאוששות מדגם אחיד. הפגנת ההליך תהיה סוואנה ווסט, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.
כדי להשיג ליאזטים התא, לאסוף את התאים של עניין לתוך צינור צנטריפוגה חרוט. ולהסיר כל פסולת תא על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולה ב 5 מיליליטר של PBS.
ומיד תן שימוש חוזר בתאים ב-600 מיקרוליטרים של מאגר תיזה טרי. להתסיס את המדגם ב 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לפני ניקוי lysates, חומר ניקוי גלולה מסיסים על ידי צנטריפוגה.
בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את lysate פינה בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש 1.5 מיליליטר על קרח. ולבצע בדיקה של ברדפורד או חומצה ביצינצ'ונית כדי להעריך את ריכוז החלבון לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. הוסף מתנול וכלורופורם כדי לתפורם ביחס של 2:1.
לנער בקפדנות כדי ליצור השעיה הומוגנית צנטריפוגה המדגם כדי לאסוף גלולת חלבון בממשק בין שלבים מיוירי ואורגני. הטיית הצינור, להשתמש במחט או קצה טעינת ג'ל כדי לשוות כמה שיותר ממס. אוויר לייבש את גלולת החלבון במשך כמה דקות.
לפני ערבוב עדין של תכולת הצינור עם 600 מיקרוליטרים של מתנול, דואג לא לשבור את גלולה. לאחר הסרת מטנול בזהירות לשטוף, לייבש את גלולת החלבון על ספסל העליון במשך כחמש דקות. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת החלבון ב-200 מיקרוליטרים של חיץ 2SHB.
ומערבולת ב 42 מעלות צלזיוס ו 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו. כאשר גלולה מומס, להוסיף 200 microliters של 0.2%MMTS ב 2SHB לדגימה. ולהדקר את החלבון במשך 15 דקות ב 42 מעלות צלזיוס ו 1, 500 מהפכות לדקה בשייקר תרמו.
בסוף הדגירה, לבצע 3:4 כלורופורם-מתנול משקעים כפי שהוכח. כדי להסיר את MMTS, להמיס את גלולה ב 100 microliters של חיץ 2SHB טרי עם מערבולת. ולדלל את המדגם עם 300 microliters של חיץ A לאחר כל משקעים.
לאחר המשקעים הסופיים, להמיס את הדגימות ב 200 microliters של חיץ 2SHB לדלל עם 240 microliters של חיץ A.Measure ריכוז החלבון שוב להפריש 40 microliters מכל מדגם כמו פקדי קלט. לפצל דגימות לשני כרכים שווים של 200 מיקרוליטרים. ולסמן את הצינורות כמו בתוספת הידרוקסילאמין ומינוס הידרוקסילאמין.
הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הידרוקסילאמין ניטרלי טרי לריכוז סופי של 400 מילימולאר לצינור פלוס הידרוקסילאמין. ו-50 מיקרוליטרים של נתרן כלורי ניטרלי שני טוחנים לשליטה השלילית, צינור הידרוקסילאמין מינוס. לאחר מכן להוסיף 30 microliters של תרחיף חרוזים TS לכל צינור.
ולסובב את הצינורות במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה לשטוף את חרוזים ארבע פעמים עם 1% SDS במאגר A כדי להסיר כל הידרוקסילאמין שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף את כל דגימות חרוזים עם שלושה microcentrifugations דקה אחת עדינה.
שאפו בזהירות את העל-טבעיים והתלכלו מחדש את חרוזים ב-500 מיקרוליטרים של 1%SDS במאגר A בכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, בעדינות לסובב את חרוזים כפי שהוכח. ושואפים כמה שיותר על-טבעי מבלי להפריע לעליזים.
כדי לשחזר את החלבונים מהחרוזים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ דגימת 4%SDS לכל צינור והדגירה את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס ו-1,500 מהפכות לדקה למשך 15 דקות בשייקר תרמו. בסוף הדגירה, תן את הדגימות להתקרר לפני צנטריפוגה לחלוטין גלולה את חרוזים. לאחר מכן השתמשו בקצה טעינת ג'ל כדי להעביר את החלבונים האלודים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר.
ולהפעיל את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE כדי לנתח את S-acylation של חלבונים של עניין על ידי כתמים מערביים. טירוסין קינאז Lck ניתן לזהות בליזטים שטופלו ניטרלי שני הידרוקסילאמין טוחן. כדי לחשוף את הקשר thioester בין שאריות ציסטאין ואת moiety חומצת שומן.
הפשטה ו reprobing עם נוגדנים נגד חלבונים Fyn ו LAT להדגים כי acyl-שף סייע ללכוד assay ניתן להשתמש כדי לנתח S-acylation של חלבונים מרובים בו זמנית. בנוסף, S-acylation של Lck, Fyn, ו LAT ניתן לזהות בקלות טחול העכבר הראשי. המציין כי שינוי זה שמור בין שני מינים.
בנוסף לזיהוי של חלבונים S-acylated הרומן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך שינויים S-acylation חלבון בתנאים ביולוגיים שונים. מספר החלבונים החדשים שזוהו S-acylated גדל מאוד לאחר כפול למעלה פירושו טכניקה מהירה ואמינה כגון Acyl-RAC. בנוסף לזיהוי של חלבונים S-acylated הרומן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך שינויים S-acylation חלבון בתנאים ביולוגיים שונים.
