この方法は、パラフィンセクションでは通常検出できないマーカーを含む単一のクライオセクション内の複数のバイオマーカーを検出し、共局化するのに役立ちます。この実験染色法を用い、染色時間が大幅に短縮され、どの研究室でも実施できます。この方法のデモンストレーションはディネシュ・ジャイシャンカルです。
彼は研究室の熟練したポスドクであり、免疫療法評価コア、施設マネージャーでもあります。分析用の抗体を選択する場合は、半自動イメージングシステムで利用可能な励起フィルタと発光フィルタセットを検討してください。また、フルオロフォア結合された一次抗体の様々な組み合わせをテストした後、表に示されているようにスペクトルの重複を最小限に抑えるためにフルオロフォアを調製します。
多重染色の場合は、所定の最適妄想で相性の高いフルオロフォアを有する抗体のカクテルを調製し、目的の組織セクションにカクテルを加えます。単一マーカー染色の場合は、一次共役抗体のみをスライドに追加します。すべての染色に対して、一次共役抗体を添加することなく同じ染色手順を経るコントロール未染色スライドが含まれる。
光から保護された室温で1時間のインキュベーションの後、PBSで2回、1回の洗浄で5分間洗浄します。2回目の洗浄後、DAPIで多重染色スライドを光から保護された室温で7分間カウンター染色し、続いてPBSで5分間洗浄します。スペクトルライブラリを作成するには、マルチスペクトルイメージングシステムのランプパワーを100%に設定し、顕微鏡動作ソフトウェアを開きます。
[プロトコルの編集] と [新しいプロトコル] を選択します。プロトコル名を入力し、イメージングモードで蛍光を選択します。次に、スタディ名を指定し、単一の染色されたスライドをステージにロードします。
露出を編集をクリックし、自動焦点と自動公開オプションを使用して露出時間を調整し、単一の染色されたスライドのスナップショットを取得します。単一の染色されたスライドを撮像した後、プロトコルを保存します。また、ビルドライブラリのタブの下の機械学習ソフトウェアで、各単一の染色された画像をロードします。
適切なフロアを選択し、[抽出]をクリックします。ソフトウェアは、フロアで選択された蛍光信号を自動的に抽出します。抽出した色を保存するには、[保存] をクリックして保存します。
新しいグループを作成するか、抽出した色を既存のグループに保存できます。マルチスペクトルイメージングの場合、スペクトルライブラリを作成して検証したら、多重染色スライドのフォーカスと露出時間を調整し、スキャンしたスライドを開いて新しいタスクを作成します。スライド ID を指定し、プロトコルを選択します。
[タスク] で、スライド スキャン全体を選択して、マルチプレックススライドでスライド全体のスキャンを実行します。スライド スキャン イメージ全体で、画像全体の対象地域を選択します。これらの領域は、スペクトルの非混合および分析に使用される多重スライド上で以前に設定された露出時間を使用してスキャンされます。
顕微鏡操作ソフトウェアで、タスクの下で MSI フィールドを取得するを選択し、[スライドを処理] をクリックして、20 倍の倍率で対象領域を取得します。対象地域を取得したら、機械学習ソフトウェアで、[手動解析] タブの [ファイルとオープン] をクリックして、マルチプレックス染色画像をロードします。スペクトル ライブラリ ソースを選択し、[床を選択]をクリックして、以前に保存したスペクトル ライブラリを選択します。
[ファイル]をクリックして[開く]をクリックして、未染色イメージをロードします。次に、自己蛍光インクマーカーアイコンをクリックし、未染色スライド上に線または領域を描き、組織内の自己蛍光を識別します。次に、[マーカーと色の編集] タブで、各マーカーの名前を割り当てて[すべて準備]をクリックします。
スペクトル的に混合されていない画像を検証した後、機械学習ソフトウェアで、パネルから細胞質膜とマーカーのオプションを選択します。そして、省略記号ボタンを使用して、この信号を使用して、核、細胞質または膜のいずれかを検出するようにマーカーを設定するために選択します。細胞質または膜マーカーを選択した場合は、「シグナルを使用して核分裂を支援する」オプションを選択します。
ソフトウェアは自動的に核、細胞質および膜のための個々のマスクを検出し、作成する。特定のマーカーの病理ビューとソフトウェアの設定オプションを使用してマスクを調整し、[セグメント全体]をクリックしてセルセグメンテーションマップを作成します。細胞のセグメンテーションの後、正のセルを表現するマーカーを選択します。
さらに、選択したマーカーで染色されていないセルを少なくとも 5 つ選択して、負のセルを表現します。次に、[分類器のトレーニング] をクリックして、イメージ内で選択したマーカーで染色されたすべてのセルを自動的に検出するようにソフトウェアをトレーニングします。表現型マップが作成されます。
これらの画像が示すように、フローサイトメトリーについて検証された抗体は、半自動イメージングシステムの液晶チューナブルフィルターを使用して組織染色を可視化するために使用することができます。ここで、凍結したヒト扁桃のスペクトル的に混ざっていない画像は、濾胞性胚中心内のB細胞および増殖細胞の標識、および濾胞間T細胞領域を含む観察することができる。病理ビューオプションは、対象組織内の各マーカーの個々の染色パターンの可視化を可能にし、多重染色法およびスペクトルイメージングが凍結組織に働くことを示唆している。
凍結マウス腫瘍セクションで示されるように、マルチスペクトルイメージングは、腫瘍浸潤T細胞、および腫瘍関連マクロファージを含む他の骨髄細胞系統を視覚化するためにも使用することができる。細胞のセグメンテーションおよび表現型マップ、およびソフトウェアによって解析された各マーカーの染色細胞数を生成することができ、凍結組織上のマルチスペクトル染色の定量にソフトウェアを使用できることを実証する。新しい6toの技術のために、あなたのフルオロクロムの特定の特徴を知り、最小限のスペクトルオーバーラップでスペクトルをアンミックスするための品質ライブラリスライドを準備することが重要です。
抗体の滴定を行うことも重要です。我々の意見では、この方法は、特にタイミングが本質である場合、癌および他の治療用途のための免疫療法の有効性に関するベッドサイド情報を提供することができる。
