心血管疾患は、世界的に死の主な原因です。マウスモデルは、この疾患を研究するための有用なツールであり、我々のプロトコルは、マウスのアテローム性動脈硬化症を定量化するために使用することができます。このプロトコルを使用して、病変サイズは3つの血管の位置で測定することができる。
大動脈根、大動脈弓および虚頭筋動脈。マウスのアテローム性動脈硬化症の定量化は、面倒な作業になることがあります。私たちは、プロセスをスピードアップできることを望む詳細な手順を提供しました。
これらの手順の一部は、書面で説明するのが難しいです。このビデオが、堅牢なアテローム硬化性病変サイズ分析を得るのに役立つことを願っています。標準的なプロトコルに従ってマウスの心臓を収穫した後、心臓をコルクのベッドの上に置き、腹側を解剖顕微鏡の下に置き、針を使って頂点を通してコルクに心臓を固定します。
心臓の基部を解剖学的鉗子で保持し、矢状平面で20度の角度で保持されたメスを使用し、横被面で20度を使用して、心臓の3分の2の頭頂部を切り取ります。最適な切断温度化合物、またはOCTに大動脈根と心臓の基部を埋め込み、軽く化合物で大動脈根を埋め、任意の気泡を除去するために鉗子で心臓を絞ります。底面に垂直な大動脈根でOCTで満たされたクリオマールの底に標本を移し、ドライアイス上の化合物を凍結します。
その後、組織サンプルを氷解するまでマイナス80度の冷凍袋に保管します。顔の分析のためにピン留めベッドを準備するには、パラフィンワックスフィルムのセグメントを8回折り畳んで平らな25×25mmの表面を作り、フィルムの周りに黒い電気絶縁テープを包んで大タオルの暗い背景を作ります。ピン留めベッドの裏側にラベルを置き、リードペンシルを使用してマウスの識別番号を記録します。
大動脈弓をピン留めベッドに移し、組織にPBSの滴を加える。ステレオ顕微鏡を使用して、残りの回来期脂肪組織から大動脈を洗浄し、ヴァンナハサミとデュモン鉗子を使用して、大動脈を操作または損傷することなく、周囲の脂肪組織をすべて穏やかに剥がします。次に、大動脈腔内にバンナハサミを導入して、内膜を露出させます。
上向きアーチの外側の湾曲を遠位方向に切断し、腕頭筋動脈を含む枝を切り開き続け、下降胸部の後部を温断します。内膜面を表示するには、曲率を小さい方の曲率で切り開き、大間を折りたたみます。マイクロカストロビエホ針ホルダーを使用して、標本を伸ばさずにニーン昆虫ピンの鈍い端でピン留めベッドにオープンアーチを固定し、組織が所定の位置に保持されると、標本からピンをそっと曲げます。
その後、4°CでPBSのペトリ皿にピン留めされたアーチのフェイスダウンを保存します。スーダンIV染色の場合、7分間、70%エタノールのペトリ皿で、アーチを下に向けてペトリ皿で洗い、その前に7分間スーダンIVの作業溶液の皿に標本を移す。インキュベーションの最後に、サンプルを80%エタノールで2回の3分間の洗剤で洗い、通常のインティマル表面を脱染色し、続いてPBSで最後のすすいでから元のペトリ皿に戻します。
その後、10倍の拡大でデジタルカメラに接続されたステレオ顕微鏡の下で顕微鏡を取得し、PBSに沈んだピン止めアーチの画像を取得し、小さな金属重量を使用してペトリ皿の底にピン留めベッドを保持します。埋め込まれた大動脈根のクライオセクションを得るためには、クライオスタット温度をマイナス20°C、セクションの厚さを10マイクロメートルに設定します。心室組織を外側に向けた標本ホルダーに大動脈根を含むOCTブロックを取り付けます。
必要に応じて、追加の OCT で位置を固定します。大動脈根はナイフ刃に対して垂直に配置されます。通常の顕微鏡スライド上の心臓筋組織を含む初期制御切片を収集し、軽い顕微鏡下で200マイクロメートルごとに組織を通して進行を確認する。
最初の大動脈カスプが現れたとき、断面平面を他の2つのカスプに揃え、点ゼロから切り取られた10マイクロメートルのセクションごとにカウントするために、試料を点ゼロカスプに向けて傾けます。計画されたスライドに従って90マイクロメートル以降から分析のためのセクションの収集を開始し、ポイントゼロから800マイクロメートルに達するまで。大動脈根の全血管面積の病変分率を計算すると、断面化中の角度差の可能性に対するデータの感度が低下します。
さらに、マウス当たりの曲線下の面積またはアテロート病変サイズを計算し、データをドットプロットで提示して、グループ内の個々の変動をさらに視覚化することも例示できる。病変脂質蓄積は、全病変領域の赤O正の領域の色閾値をオイルで定量することができる。右および左の冠状動脈は、通常、大動脈から大動脈から250マイクロメートル程度の大動脈から発散し、しばしば最も顕著な病変サイズと一致する。
顔大動脈アーチの代表的な画像の暗い背景を削除すると、視覚的な表示を強化することができます。病変サイズは通常グループ内に分布し、グループ間でスチューデントのt検定を使用した統計分析が可能です。実験サンプルを処理するための十分なスキルを習得するまで、いくつかのテスト資料を使用して練習することをお勧めします。
病変サイズがグループ間で異なる場合は、病変組成分析が通常追求する次のステップであるため、メカニズムを決定する必要があります。
