mRNAエレクトロポレーションは、鳥類モデルシステム内の複数のタンパク質の迅速、効率的、および空間的および時間的に制御された発現を提供します。この方法は標準的なDNAエレクトロポレーションによって達成される標識より蛍光タンパク質のより広く、速い表現を可能にする。エレクトロポレーションは、RNAやDNAなどの遺伝的ペイロードを多数のモデル生物の細胞に移管するための導管として機能する原形質膜中の細孔の一過性の開口部を促進する。
最初の実験では、エレクトロポレーションのような外部操作に対してより硬く、より耐性があるため、1日齢の胚で動作します。適切な胚発生段階で、ウズラの卵の内容物を穏やかに分解し、10センチメートルのペトリ皿に注ぎます。転送ピペットを使用して、厚いアルブミンの大部分を取り除きます。
ラボ組織を使用してヨークの表面を静かに拭き取り、胚の周りの残りの厚いおとびんを取り除き、胚が紙のリングにしっかりとくっつくことを確認します。プレカット濾紙を胚の上に置き、はさみを使って胚の周囲を滑らかに切断する。パスツールピペットを使用して、穏やかな流れを使用して胚の下にPPSを重ね、組織に付着するヨークを空にします。
卵子の斜めの角度でゆっくりと胚紙リングを引っ張ります。さらにクリーニングするためにPBSで満たされたペトリ皿に紙を置きます。ヨークの大部分を取り除いたら、胚腹側を寒天と卵形の半固体混合物で覆われた35ミリメートルのペトリ皿に上に置きます。
黒い電極をPBSで満たし、胚を内部に置いて、エレクトロポレーションチャンバーを準備します。ガラスマイクロキャピラリーを使用して、所望の領域を覆うエピブラストとビテリン膜の間の空洞に200ナノリットルのmRNAのボーラスを注入します。そして、赤い電極を使用して胚を電気ポレートします。
電気ポレートされた胚を寒天アルブミン混合物の上に戻し、所望の発達段階まで摂氏38度でインキュベートする。エレクトロポレーションコード化された蛍光タンパク質のイメージングのために、蛍光解剖ステレオスコープの下ですべての電気ポレート胚を観察し、動的イメージング実験のための最も健康的で最良のエレクトロポレート胚を選択します。他の電気メッキ胚と非電気メッキ胚を別のインキュベーターにインキュベートし続ける。
選択した胚をPBSで簡単にすすいで、エレクトロポレーション中に胚の後側に形成された可能性のある気泡を除去する。洗浄された胚を、胚の後部表面に気泡を発生しないように注意して、約150マイクロリットルのアルブミン寒天の薄い層を含むイメージング皿に直接入れます。イメージング皿の内側の端に沿ってティッシュペーパーを巻き上げた小さな湿った部分を追加します。
画像化およびインキュベーション中の蒸発を最小限に抑えるために、パラフィンフィルムで皿を密封します。皿を共焦点顕微鏡の前温められた段階に素早く動かし、明視野チャネルを使用して胚の色染料を見つける。イメージングソフトウェアを目的の目的、二色性ミラー、発光スペクトルに設定し、適切なレーザーをオンにします。
細胞は、映画全体の画像ビジョンに残ることを注意してください。十分な高いイメージング解像度を使用し、画像処理条件が光毒性を引き起こさないことを確認してください。イメージングソフトウェアでLiveをクリックし、各顕微鏡レーザーパワーに応じて蛍光強度に適した設定にレーザーパワーを調整します。
1%レーザーパワーと800ゲインを使用して胚のイメージングを開始し、飽和ピクセルが見えるまでレーザーパワーを1%ずつゆっくりと増加させます。飽和ピクセルが観測されると、飽和ピクセルが可視化されなくなるまでレーザーパワーをわずかに低下させます。イメージングセッション中に胚がアガロースベッドに沈んだ場合に備えて、3~5分ごとに胚を画像化し、エレクトロメッキ領域全体の5マイクロメートルZスタックを使用して、Zスタックの底に向かって余分なスペースを持つ個々の細胞の移動をチェックします。
セルの移動速度を観察するには、最初のムービーの最初の数ポイントを確認します。セルが高速で移動している場合は、画像領域のズームを拡大するか、別の領域をイメージングすることを検討してください。胚の電気メッキ領域全体が画像化された場合、同じ胚の無電気メッキ領域における画像は、自己蛍光レベルを決定する。
ステレオ顕微鏡上で目的の遺伝子のエレクトロポレーションを確認した後、トランスフェクトされたmRNAを蛍光タンパク質に翻訳できる期間を決定するには、胚を反転共焦点顕微鏡の予熱段階に置き、70%レーザーパワー、100回の反復、および4つのスキャン速度を使用して、エレクトロプレートから蛍光を4回使用します。写真の漂白後に36°Cでステージ上の胚をインキュベートし続け、健康な胚でのみ一般的に見られる光漂白領域内の積極的に分裂する細胞に注意を払い、したがってエレクトロポレーションが胚細胞に害を与えなかったことを示す。電気メッキ領域のポスト漂白剤Zスタック画像を、通常の3〜5分の時間間隔で所望の時間の長さで取得します。
イメージング条件が、画像化のためのコントロールとして機能するようにフォトブリーチされていない電気メッキ胚を同時にインキュベートする胚生存に有害な影響を与えないことを保証する。mRNA崩壊後エレクトロポレーションの光漂白結果を定量化するには、ImageJを使用して、各セルのエレクトロメッキ領域の中心にある7.5マイクロメートル円の蛍光強度を測定し、3~5分間の間隔で細胞蛍光を追跡します。有糸分裂を受けておらず、完全に光漂白された光漂白領域内の全ての細胞が測定された場合、胚をフォトブリーチした各時点で経時の漂白後の蛍光強度をプロットする。
DNAエレクトロポレーションは一部の電気メッキ細胞において蛍光を明るくするが、広く発現しているmRNAコード化された蛍光タンパク質に比べてDNAエレクトロポレーションの効率は目に見えて低い。同じ胚内のDNAとmRNAの共エレクトロポレーションを比較すると、蛍光タンパク質効率を発現するDNAも、蛍光タンパク質を発現するmRNAのそれと比べて効率が著しく一貫して低い。mRNA、DNA、または2つの組み合わせだけで電気メッキされたすべての胚の定量化は、mRNAが所定の領域の細胞の約75%をトランスフェクトし、DNAは細胞の約25%しかトランスフェクトしならないことを明らかにします。
トランスフェクトされたmRNAは、細胞質翻訳機によってmRNAをすぐに認識できるため、トランスフェクトされたDNAに比べてタンパク質産生が速くなるはずです。複数のDNAの共エレクトロポレーションは比較的非効率的であることが以前に示されていましたが、この実験で4つのmRNAのコエレクトロポレーションを行うと、すべての電気メッキ領域内の4つのmRNAすべてについて87%のトランスフェクション効率が得られた。光漂白は、最初は約95%の細胞によって光漂白細胞の蛍光強度を減少させるが、エレクトロポレーションの直後に蛍光タンパク質を分裂し、発現する能力を回復する細胞の一部が残っている。
しかし、この能力はエレクトロポレーション後5時間にわたって低下します。最適なイメージング条件を最適化し、必要に応じて調整する準備ができて映画を開始した後も、いじり続けてください。
