このプロトコルにより、研究者は初期胚発生時に変異型イソギンチャクを同定し、胚発生後の表現型を分析することができます。この技術の主な利点は、動物の生命を犠牲にすることなく、早期に個々のイソギンチャクを遺伝子型化することができるということです。この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるミゲル・シルバです。
産卵誘導の前日に、アネマトステッラの静脈を温度および光制御インキュベーターに入れ、動物が摂氏25度で8時間の光にさらされるようにインキュベーターをプログラミングする。翌日、インキュベーターから動物を取り出し、室温のベンチトップにライトを当て、産卵を可能にします。チップを切って開口部を拡大し、メス容器の卵パッケージを精子を含む男性容器に入れ、受精を可能にするために少なくとも15分間男性容器に入れます。
受精後、卵のパッケージを脱ゼゼするには、ガラスペトリ皿の上に3%システインを含む海水に入れ、シェーカーの上で12分間静かに攪拌します。その後、プラスチック製のピペットで塊を分割し、完全にデジェリになるまでさらに2〜3分間攪拌し続けます。受精卵は同じ皿の上に摂氏16度または室温で保管してください。
翌日、原稿に記載されているとおりにDNA抽出バッファーを調製し、ボルテックスでよく混合し、各チューブに20マイクロリットルを加えてPCRチューブにアリコートします。海水に1%アガロースを溶かし、底を覆うためにペトリ皿に注ぎ、ベンチトップで冷やしてゲルベッドを作ります。ゲルベッドに新鮮な海水を覆います。
ピペットを使用して24時間受精後の胚をアガロースゲルベッド含有ペトリ皿に移す。タングステン針を必要ホルダーに挿入し、チップをアルコールに浸し、炎に入れてアルコールを燃やして殺菌します。解剖顕微鏡の下で、タングステン針を使用して、操作する胚の大きさの表面アガロースの一部を除去することによって、アガロースにうつ病を作る。
次に、タングステン針を使用して、胚をうつ病に入れ、その側側を下にして、微小手術のための胚の動きを制限する。手術を成功させるためには、胚の動きを制限することが重要です。タングステン針で、口腔の斜口開口部の反対側に位置する口腔腹腔軸に沿って、腹腔組織の一部を外科的に除去する。
P20ピペットを用いて、DNA抽出バッファーの20マイクロリットルを含むPCRチューブに単離された腹腔組織を移す。手術後の胚を、少なくとも500マイクロリットルの淡水を含む24ウェルプレートの井戸に移す。そして、ジェノタイピングが完了するまで、手術後の胚を含むプレートをインキュベーターに摂氏16度で置きます。
単一胚からゲノムDNAを抽出するには、まず、ミニ遠心分離機を使用してDNA抽出バッファーおよび単離胚組織を含むPCRチューブを簡単にスピンダウンします。その後、30分ごとに30秒間ボルテックスしながら3時間摂氏55度でチューブをインキュベートし、細胞塊の分解を確実にし、細胞のライシスを増強します。プロテイナーゼKを摂氏95度で4分間不活性化した後、抽出されたゲノムDNAを鋳型にして、目的の遺伝子座を増幅するPCR反応を設定します。
原稿に記載されているとおりに、目的のプライマーを設計します。20マイクロリットルPCR反応を設定します。PCRを完了した後、アガロースゲル電気泳動を実行してPCR産物のサイズと存在感または存在を決定し、PCR産物の予想サイズに応じてアガロースゲル電気泳動の状態を調整してください。
サイズと存在または不在またはPCR産物に関するPCR結果を使用して、外科手術後の胚ごとに遺伝子型を割り当て、その遺伝子型に従って胚を並べ替えます。線虫ステラゲノムは、ニューロペプチドGLワミドの前駆体タンパク質をコードする単一の遺伝子座を有する。軌跡における3つのノックアウト突然変異対立遺伝子が以前に報告されている。
Aノックアウト対立遺伝子を運ぶヘテロ接合系女性とCノックアウト対立遺伝子を運ぶヘテロ接合性雄との間のF1十字架の子孫の間で無作為にサンプリングされた胚から得られたPCR結果は、異なる遺伝子型を示す。胚1及び2は、Aノックアウトアレールの予想サイズに対応する単一のPCRバンドを示す。胚3および6は、ノックアウトアレスAおよびC.胚4、7、および8に予想されるサイズを有する2つのPCRバンドを示し、Cノックアウトアレーレの予想サイズに対応する単一のPCRバンドを示す。
胚5はバンドを示さない、プライマー結合の欠如を示唆する。ゲノムDNA抽出失敗の可能性を排除するために、野生型配列に結合できるリバースプライマーを用いて別のPCRを実行した。予想サイズのPCR産物が検出されたところで、ゲノムDNA抽出が成功した。
一方、抽出の失敗を示唆した製品はなかった。このプロトコルはイソギンマの胚のために設計されていますが、ゲノム情報や胚がアクセス可能なサンゴやクラゲなどの他のクニダリアンにこの方法を適用することは確実です。この手順に従って、同定された変異体は、発達表現型を評価するために使用される。
例えば、免疫染色などの組織学的手法を使用して形態の欠陥を評価し、その際に遺伝子の発現の欠陥を評価するために、その際に、リアルタイム定量的RT-PCR、およびRNA-seqを用いることができる。また、生画像化は、幼虫や初期ポリープなどの胚後の発達中の挙動の欠陥を評価するために使用することができる。
