私たちのin situプロトコルは、最小限のバックグラウンド染色で遺伝子発現パターンを視覚化する簡単な方法を提供するため、重要です。この手法により、複雑で長いプロトコルを比較的簡単に実行できます。Benchtop は提案とチェックリストを設定し、このプロトコルを正しく実行し、再現することがさらに容易になります。
ここで示す技術はアスティヤナックスメキシカーヌスに固有のものですが、プロトコルにわずかな調整を加えた同等のサイズの個人の他のシステムに適応する可能性があります。まず、色付きのラボテープを使用して、各遺伝子のバイアルとピペットを指定します。パスツールピペットを使用して、胚をソートします。
通常、バイアルあたり12個以下の胚は、一度ソートされる。次に、振れる水浴を摂氏70度に設定します。慎重に選別胚のバイアルにメタノールを引き出し、新鮮な100%メタノールの500マイクロリットルに置き換えます。
プラットフォームシェーカーで約1分間、胚を短時間洗います。この後、テキストプロトコルで概説されているように、プラットフォームシェーカー上のTween 20で1x PBSの濃度を増加させるに胚を再水和する。まず、メッシュ底の小さなガスケットを、摂氏70度に予熱された回転ウォーターバスに入れます。
ハイブリダイゼーションバッファーマイナスとハイブリダイゼーションバッファープラスのアリコートをガスケットに入れます。調製したPK溶液を胚のバイアルに静かに加え、すべての組織が完全に溶液で覆われていることを確認します。バイアルをプラットフォームシェーカーに移し、プロテイナーゼKの働く溶液で約12分間消化させます。
この後、PK溶液をそっと引き出し、PBTでバイアルを短時間フラッドして残りのPKを希釈します。PBT溶液を500マイクロリットルの新鮮なPBTに交換し、プラットフォームシェーカーで5分間溶液をすすいでください。その後、PBT溶液を解凍した4%PFAの500マイクロリットルに交換してください。胚を室温でプラットフォームシェーカーに20分間インキュベートさせます。
プレハイブリダイゼーションを開始するには、胚含有バイアルに500マイクロリットルのプレウォームハイブリダイゼーションバッファーマイナス溶液を加えます。5分間振らずに70°Cの水浴中のガスケットにバイアルを慎重に入れます。次に、ハイブリダイゼーションバッファーマイナス溶液を引き出し、500マイクロリットルのプリウォームハイブリダイゼーションバッファーと溶液でバイアルをフラッディングします。
バイアルを水浴のガスケットに戻し、4時間または一晩揺れでインキュベートします。ハイブリダイゼーションを開始するには、バイアルからハイブリダイゼーションバッファプラスを引き出し、500マイクロリットルのフレッシュプリウォームハイブリダイゼーションバッファプラスに置き換えます。各バイアルに2マイクロリットルのRNAプローブを慎重に追加し、プローブの均等な分布を確保するために穏やかに旋回します。
40 RPMで振りながら、一晩摂氏70度で水浴中にインキュベートします。まず、テキストプロトコルで概説されているように、ハイブリダイゼーションバッファーに加えて、目的のRNAプローブの遺伝子を標識したマイクロ遠心チューブを調製する。2つの15ミリリットルの円錐形チューブをセットし、0.2グラムのブロッキング試薬と10ミリリットルのMABTを加えます。
試薬が溶液に完全に溶解するまで、両方のチューブを栄養ミキサーの上に置きます。ガラスパスツールピペットを使用して、ハイブリダイゼーションバッファープラスとプローブ溶液を取り出し、滅菌標識マイクロ遠心チューブに入れます。このチューブは、将来の使用のためにマイナス20°Cで冷凍庫に保管してください。
500マイクロリットルの温かい生理食塩水ナトリウムとハイブリダイゼーションバッファーから希釈液を差し引いたものを慎重に加えます。順次溶液でそれぞれ10分間、揺れる水浴でインキュベートし、次にテキストプロトコルで概説されているようにプラットフォームシェーカー上の室温でインキュベートする。最後のインキュベーションの後、MABTの500マイクロリットルで各バイアルから100%PBTを交換してください。
このプロセスを 5 分間繰り返します。まず、各バイアルからMABTを取り出し、15ミリリットルの円錐管の1つからプレミックスブロッキング溶液であふれます。両方のバイアルを、常温で4時間、栄養ミキサーに置きます。
調製されたブロッキング溶液と短い渦の第2のチューブに抗体断片の2マイクロリットルを追加します。その後、ブロッキング溶液で各バイアルをほぼ完全に充填し、摂氏4度の冷蔵庫で一晩栄養ミキサーに置きます。まず、MABTで10%NGSのストックバイアルを準備します。
各バイアルのブロッキング溶液を、このNGS溶液の500マイクロリットルに交換してください。プラットフォームシェーカーの室温で25分間インキュベートします。この後、NGS混合物を100%MABTの500マイクロリットルに置き換えます。
プラットフォームシェーカーを室温で30分間インキュベートします。このすすを1日を通して、30分ごとにさらに11回繰り返します。その後、100%MABTで各バイアルを充填し、摂氏4度で冷蔵庫で一晩栄養ミキサーに置きます。
まず、各バイアルのMABTを1ミリリットルのAPバッファに交換し、5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返してMABTを完全に取り除きます。次に、3.5マイクロリットルのBCIPと4.5マイクロリットルのMBTを含む新鮮なAPバッファの1ミリリットルにAPバッファを交換してください。
反応が完了するまで1時間ごとにBCIPとMBTを含むAPバッファの新鮮な混合物と交換し、反応を注意深く監視し、所望のレベルの染色が達成されるまで15分ごとにチェックしてください。プロトコルで概説されているように、APバッファ内の1X PBTの濃度を増加させて胚をリンスすることにより、着色反応を停止する。目的の最小バックグラウンド染色に達するまで、栄養ミキサーで約5ミリリットルの100%PBTで胚をリンスします。
すすいが完了したら、プラットフォームシェーカーで500マイクロリットルの無菌PBSで胚を洗浄し、テキストプロトコルに概説されているように標本を後置します。胚をすすいだ後、100%無菌PBSの4ミリリットルに入れ、必要に応じて摂氏4度で長期間保存する。本研究では、胚性アスティアナックス標本は、高品質の遺伝子発現解析のために標識されている。
このプロセスは、パチョン洞窟魚と表面魚の胚の両方で正常に実装されています。Sox9発現に標識された洞窟魚の胚は、発達中の分岐アーチおよび胸部フィンにおける明確な標識を示す。黄身嚢または脇腹の発育中のスマイトには、染色が事実上存在しない点に注意してください。
同様に、Tfap2a発現は、胚の側側側領域に沿った早期移行神経堤細胞として発達中頭部の部分に明らかである。洞窟魚の胚のために提示された3番目の遺伝子、Phf20aは、骨組織を生み出す運命にある体細胞中胚および後頭部の部分に見られる。CXCRに標識された表面魚の胚は、頭部および側面の単離された領域における陽性標識を示すとともに、黄身嚢の上にあるいくつかの個々の細胞を示す。
遺伝子Adcyap1aは下垂体細胞を含む中枢神経系の領域で発現される。胚の後ろ面における細胞の対両側クラスターにおける非常に特異的な発現と、正中線発現のより大きな領域に注意してください。洞窟魚の胚について最後に調べた遺伝子Sox10は、後部胚の左右の神経堤の初期マーカーとして明らかである。
その後、我々は通常、光顕微鏡を使用して結果を画像化します。染色の劣化を避けるために、完了後2週間以内にこれを行うことをお勧めします。
