このプロトコルは、マウスの呼吸パターンを測定するために使用することができます。重要なことに、結果を混乱させる可能性のある遺伝子組み換え株における活動的な行動の影響を最小限に抑えることができる。この技術の主な利点は、それが非侵襲的であり、麻酔またはストレス誘発拘束の使用を必要としないことです。
まず、すべてのホースとチューブが気圧プレチスモグラフチャンバーに接続されていることを確認し、ガス流入管と真空流出管を気圧プレチスモグラフィーチャンバーに直接接続します。チャンバーへの低流れを較正するには、チャンバーの出入り流れをゼロに設定し、チャンバーに流れ管を取り出します。真空をオフにし、低ユニットセルにゼロを入力して、気圧プレチスモグラフソフトウェアの7700アンプ設定でゼロフローを記録します。
次に、流入管を再び取り付け、真空流をオンにして高流量を較正し、20.93%酸素バランス窒素ガスがガスミキサーから気圧プレチスモグラフィーチャンバーを流れるようにします。次に、1 分あたりのリットルから流量計から測定した流入値を 1 秒あたりのミリリットルに変換し、高い単位セルをクリックしてミリリットル/秒単位で値を入力します。高カルをダブルクリックし、3秒に時間を変更し、[測定]をクリックします。
その後、7700アンプの設定タブを開いたままにして、代謝分析装置を気圧的プレチスモグラフィーソフトウェアにキャリブレーションします。代謝分析装置を校正するには、ガスミキサープログラムで、ガスミキサーを20.93%酸素と79.07%窒素に設定します。また、代謝分析装置で酸素キャリブレーションレベルを 20.93%に設定し、二酸化炭素を 0%に設定し、適切な値がガス分析装置に入力されたらダイヤルを戻してサンプルに戻し、高い酸素と低二酸化炭素の割合を設定します。
気圧プレチスモグラフィーソフトウェアのABCD 4タブをクリックし、酸素用C2ラインの高い単位の下に20.93を入力します。[高いカル]の下で、時間を3秒に変更し、[測定]をクリックします。二酸化炭素の C3 ラインの低カロリーの下にゼロを入力します。
次に、時間を 3 秒に変更し、低 cal の下の [測定] をクリックします。ガスミキサープログラムでは、酸素値を10%に、二酸化炭素値を5%に変更し、ガスの流れがこれらの値に調整されるまで数分待ちます。代謝分析計では、調整ノブを回して二酸化炭素を5%に調整し、値がキャリブレーションされたらダイヤルをサンプルに戻すように注意してください。
アナライザの読み取り値が安定していることを確認した後、C3 の下の高い単位をクリックし、二酸化炭素の値を 5 つ入力します。次に、高いカルを 3 秒に変更し、[測定] をクリックします。C2 オプションの下の低い単位をクリックし、酸素の場合は 10 と入力し、低カルをクリックし、3 秒入力して[測定]をクリックします。
ガスミキサーを20.93%酸素と79.07%窒素に戻し、チャンバーがこれらの値に調整されるまで数分待ちます。認定ガスタンクを使用して追加のキャリブレーションを定期的に実行し、フローミキサーと酸素二酸化炭素分析装置が正常に動作していることを確認します。代謝分析計が較正されたら、気圧プレチスモグラフチャンバーに接続されている流量計を再確認し、チャンバーの出入りする空気の流れを調整して実験に適した速度にします。
すべての設定が気圧プレチスモグラフィソフトウェアに適用されたら、[取得]タブの[閉じる]をクリックし、[取得開始]をクリックしてファイルに名前を付け、[OK]をクリックして記録を開始します。拘束されていない気圧胸膜撮影の場合は、マウスをホームケージに戻す前に、マウスの体重と初期体温を記録します。
空のチャンバーから背景酸素と二酸化炭素データを収集してから、マウスをチャンバーに入れるまで10分間待ちます。最初の1時間の間に、チャンバーのインと流出の特定の値を含む詳細なメモを取る動物の行動を文書化する。チャンバーの習慣の終わりに、埋め込み型デバイスを使用する場合、10分ごとに体温測定を行う次の60分間、静かな呼吸のセグメントを監視します。
スニッフィング、グルーミング、探索を行わなくなって、穏やかな呼吸のインスタンスを適切に識別できるように、一般的なマウスの動作に慣れるよう注意してください。実験の最後に、マウスをケージに戻し、機器を完全にきれいに拭き取ります。代謝分析のために、ソフトウェアで代謝パネルを開き、チャンバーが空だったときから酸素および二酸化炭素レベルの最初の10分の平均を得る。
気圧プレチスモグラフィソフトウェアのフローパネルを表示し、属性の分析を右クリックして適切なパラメータを設定します。呼吸解析のパターンでは、動物の行動に関するメモとフローパネルのトレースを使用して、静かな呼吸の15秒間の時間を確認します。次に、[データ パーサー] タブから開いているパーサー ダイアログの下の時刻を入力し、[パーサー表示モード] をクリックして、特定の 15 秒の対象セグメントのみを表示します。
無呼吸と拡張ブレスを分析するには、開いているレビューファイルでパーサ表示モードを終了し、[P3 セットアップとグラフ設定の設定]をクリックしてタイプとしてページビューを選択し、ペインの数として5つ選択します。低とラベル付けされたボックスにマイナス 2 を入力し、1 秒あたりの流量の高いラベルのボックスに 2 を入力し、変更を適用します。次に、フロートレーシングパネルの30分のマークまでスクロールし、マウスがチャンバーに置かれた後の30〜60分の間、無呼吸と拡張呼吸を手動でカウントします。
この分析では、0.5秒以上続く中断呼吸の期間は、無呼吸を示す。拡張呼吸は、毎秒1.25ミリリットルを超える呼吸痕跡の急激な上昇によって示され、続いてマイナス0.75ミリリットル/秒を下回る急激な減少が続く。生後22ヶ月のマウスの静かな呼吸のこの代表的な流れのトレースは、呼吸がアクティブな呼吸行動と一致しないパターンの典型的なものです。
この呼吸パターンは、マウスがチャンバーのスニッフィングやグルーミングを探索していたよりアクティブなセグメントからのもので、この方法論に使用される呼吸コレクションの種類には適していません。2つの時点間の呼吸差の可能性パターンの評価のために選択されたパラメータは、呼吸頻度、潮量、微小換気、潮量吸気時間比、および微小換気排出二酸化炭素比であった。さらに分析は、周波数、潮流、微小換気、潮量吸気時間比、および微小換気排出二酸化炭素比の4つの15秒ベースラインセグメントのそれぞれについて行った。
いずれの時点とも有意な差はなく、呼吸測定のパターンに対する4つの時間セグメントの間に変動性の違いは見つからなかった。拘束されていない気圧プレチスモグラフィープロトコルの30〜60分の間に各動物に観察された無呼吸および拡張呼吸の数を定量化すると、老化した動物は30分以内に多数の無呼吸および拡張呼吸の存在を示すことを明らかにした。研究者はまた、低酸素症や高カプニアなどのガスの課題を採用して、介入または治療に起因する呼吸パターンの変化を文書化することができます。
この技術は、異なる行動の違いを示し得る小さなげっ歯類および遺伝子組み換え動物株における呼吸のパターンを特徴付けるための手段を提供する。
