We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

注：以下の実験手順は、モナッシュ大学の動物倫理委員会によって承認され、科学的目的のための動物の管理と使用（2006）の実践のためのオーストラリアの規範に従って行われる。代表的な結果を生成するために使用される成体雌C57BL / 6マウスをモナッシュ動物Servicesから入手した。マウスを、12時間の明暗サイクルで、特定病原体を含まない、温度および湿度制御された部屋で飼育した。これらのマウスは、餌と水を自由に摂取させた。 1。初期セットアップ<ol><li> USBケーブルを介して記録するためのデータ収集マシンにラップトップ/デスクトップを接続します。 </li><li> BNCケーブルを経由してデータ収集機の「入力1」に「出力1」からブリッジ·アンプを接続します。 </li><li>オクタルブリッジアンプの「チャンネル1」への圧力変換器を挿入します。上のデータ収集機を回して、解析ソフトウェアを開きます。ソフトウェアは自動べき自動的（資機材の表を参照）機器のセットアップを検出する。 </li><li>ソフトウェアのセットアップツール·バーに見つかったオープンチャンネル設定。変更チャンネル数は1に記録されている。 </li><li>室内圧力とブリッジアンプを校正する水柱装置を測定するための気圧計を設定します。水柱装置は、プラスチックチューブによって接続された2つの5ミリリットル血清シリンジピペットを含む。 </li><li>水で列を記入し、水位が定規とバランスしていることを確認。プラスチックチューブの一枚は、各ピペットの上部に接続します。 図2は、セットアップ水柱を示しています。 </li></ol> 2橋アンプキャリブレーション注：水柱への空気の注入は、1cmのH 2 O撓みを作 ​​成するために必要とされるブリッジ増幅器を較正する。これは条件の単一のセットの下で発生し、ユーザの装置に依存しているでしょう。明確にするための手順は、Dこの研究室では、キャリブレーションを実行する方法emonstrate。 <ol><li> 300μlに1mlシリンジを撤回。水柱の右側のチューブの端に活栓にシリンジを取り付けます。注：ストップコックをシリンジと水柱に開放されていることを確認し、室内の空気を閉じた。水位は、この時点でバランスされていない場合は、室内の空気と水の塔に開いていること、これが水を再調整しますので、ストップコックを回します。水柱の左側のチューブは、シリンジの急落によって誘発される圧力の変化を測定するために圧力変換器に接続されるべきである。 </li><li>圧力トランスデューサ（変換器のトップリング）上のコネクタに左側に水柱からチューブを取り付けます。 </li><li>ソフトウェアの右側にメイン画面で1チャンネルと「ブリッジ·アンプ」を（資機材の表を参照）を選択するために、次の発見スクロールダウンメニューを選択します。 </li><li>入力する5 mVの、20Hzのローパス、への設定が「反転」ボックスをチェックし、「ゼロ」をクリックします。 〜0mVにトレースを設定するために「ゼロ」をクリックしてください。見やすく1：4にウィンドウサイズを小さくしてください。 </li><li>すべてがセットアップすると、3秒のためにそれを残して、1ミリリットルの注射器を押し下げる。圧力が変更されているので、これはソフトウェア上で突然のスパイクが表示されます。 300μlを押されると、圧力を1cmによって水柱の中の水を移動します。この既知の値は、ブリッジ·アンプを校正するのに役立ちます。 NOTE：起因300μlの押下にチャンバ内の圧力の増加は、後の計算に使用されるP K値に相当する。 </li><li>ブリッジアンプウィン​​ドウの左下隅に見られる「入力装置」を選択します。 </li><li>前そうでなければ「ゼロ地域」として知られているスパイクの「バックグラウンド·トレース」を強調表示します。 <ol><li>次の「ポイント1」の横にある矢印をクリックして、このは、BACが生成されます-0.002 MV-0.002 mVの（値が正確に0mVになることはありません）の範囲内でkground信号。 </li><li>バックグラウンド信号ウィンドウに隣接したウィンドウで入力し、「0」。 </li></ol></li><li>シリンジが押下されたときから「グラフの増加圧力領域」を強調表示します。次のポイント2にある矢印をクリックし、値は0.9〜1.2 mV程度の範囲であるべきである。 <ol><li>タイプ「1」の横に「増加圧力」ウィンドウにウィンドウ内。ステップ2.7および2.8上で視覚的に明確にするためのオクタルブリッジアンプの損傷を示している可能性があり、指定した範囲外で見つかった3。値の図に対応しています。 </li></ol></li><li>ウィンドウの右上隅で発見&#39;単位を定義」を選択し、「CMH 2 O」に進みます。このオプションが利用できない場合は、手動で入力することができる。 [OK]をクリックします。 </li><li> （2.1参照）「ブリッジアンプ」メニューに戻ります。 1 mVのを選択し、「ゼロ」にアンプを設定;。これは、キャリブレーションを完了し、水柱を安全に取り外すことができます。 </li></ol> 3録音肺機能<ol><li>マウス（g）を秤量する。注：前の生理的評価に1週間容積脈波室環境にマウスをご紹介します。これは順化を支援し、後日、この手順を実行する際のストレスを軽減します。 UWBPのセットアップを示す全体概略については、 図4を参照してください。 </li><li>直腸体温計で体温を測定します。挿入前ワセリンで温度計に注油。温度読み取りを記録し、80％（v / v）のエタノールで潤滑油をきれい。そのような新生児の仔マウスのような非常に小さい動物を使用する場合は、平均体温値が代わりに赤外線温度計を用いて測定することができる。 </li><li>プレチスモ室の1穴の端に温度/相対湿度プローブを配置します。温度、湿度、barometrを記録内でマウスを配置する前に、容積脈波室内のIC圧力。 </li><li>容積脈波チャンバ内にマウスを置き、わずかに開いた端部を覆う。これは、マウスが順応することができます。チャンバを閉じます。 </li><li>一つの穴を持つプレチスモ室側に挿入された温度/湿度プローブを用いて、今2穴の反対側にある変換器と注射器を挿入します。 </li><li>約15〜45秒間、ソフトウェアプログラムおよび記録を押し「スタート」。動物が動いていないデータのレコード5-10秒。運動は、動物の基礎呼吸生理を変化させ、悪い結果をもたらす。呼吸は、プログラム上の直線経路で発振する必要があります。これらは、使用可能なデータです。注：排尿または排便のプレチスモグラフィーチャンバー内の温度および湿度の上昇につながる可能性がある。これは分析中に結果を不明瞭にします。排尿や排便の際には、すぐに録画を停止およびPLをきれいに80％（v / v）エタノールでethysmographyチャンバ。データは拒否されるべき次善の結果、視覚的に表現するために、図6を参照してください。 </li><li> 45秒間記録した後、プレス機のソフトウェア上の「停止」（資機材の表を参照）のプログラム。容積脈波室からマウスを取り出し、すぐに室内の温度と湿度を記録します。これは動物にストレスを可能として、継続的に45以上の秒間記録しません。 </li><li> 80％（v / v）のエタノールでスプレーチャンバと拭いて、そのケージにマウスを返します。 </li><li>チャンバーを乾燥し、次のマウスへ進む前に、ベースライン温度と湿度に戻れるように。繰り返します、その後の動物のための3.1〜3.9を繰り返します。注：複数の動物が研究されている場合は、それぞれの新しい動物の前に近くのベースライン値、チャンバの温度と湿度の戻りがチャンバに入れていることを確認します。 </li></ol> 4。プレチスモグラフ分析いいえテ：そのような一回換気量（V T）および分時換気量等の呼吸パラメータを計算するために以下の変数を測定する必要がある：呼吸数（呼吸/分）、全呼吸サイクル時間（秒）、吸息/呼気時間チタン（Ti / Teとによりそれぞれ一回換気量（P T）。秒）、圧力の変化は、1トレースから測定可能な変数を示している図 。次の手順は、これらの変数を測定するために（資機材の表を参照）ソフトウェアを使用しています。分析する際に、盗聴や移動を含む微量の領域を避ける。再現性のある結果を得るためには、良好な呼吸トレースの少なくとも5秒が必要です。異なる呼吸トレースの例については図5および図6を参照してください。 <ol><li> 、フルスクリーンに画面を開き1、ビューを設定します。1と、使用可能なデータの5秒を選択します。この代表的なスナップショットが図5に示されている。 </li><li>プロの一番上に見つかったミニデータパッドウィンドウを開きますDATAPADタブでグラム。チャンネル1を選択し、右側の列の左側の欄の「周期測定」と「平均的なサイの高さ」を選択します。 <ol><li> 「オプション」を選択して、1秒（msec）の最小ピーク検出のためのスケールを設定します。これは、すべてのピーク値の検出を可能にし、小さな振動を生成小動物を使用する場合に非常に重要になるであろう。 </li><li> 「OK」をクリックします。これは（P、T）の測定」各一回換気量による圧力たわみ」を紹介します。 </li></ol></li><li>ミニデータパッドには「イベント数」に続いて、選択 &#39;サイクルの測定」と「OK」をクリックしてください。これは「周波数」（f）の測定を紹介します。 <ol><li>周波数は呼吸/分に変換する必要がある。これは、60秒して値を掛け、（min）を記録する全体的な時間で答えを割ることによって行われます。 </li></ol></li><li>ミニデータパッドで、[&#39;CYCLE測定期間 &#39;が続く&#39;をクリック &#39;&#39; [OK]をクリックします。これは「総呼吸サイクル時間」（T TOT、秒）の測定を紹介します。 </li><li>次のステップは、ピーク吸気と呼気時間値を生成するために、マクロ命令を作成するために使用される。カーソルが直接ピーク/トラフの最大を超えていることを確認し、9シーケンシャル山と谷にコメントを追加します。 図5に示すように振動のピークから始めます。 </li><li>続いて、選択ウィンドウ：データパッド、右側の欄の左側の列、「期間」で「選択情報」をクリックし、「OK」をクリックして表示されるウィンドウで列1。 </li><li>マクロプログラムの先頭に記述され選択してから、録音を開始。今selectコマンド：「ファイルのスタート」、「行く」、「検索」と「検索」をクリックします。 </li><li>コマンドを選択します。「検索」とのコメントを検索 &#39;。提供さ &#39;を含む&#39;ボックスにコメントボックスの入力したのと同じフレーズを入力します。 」を選択前のポイントに &#39;タブを選択し、「検索」。 </li><li>コマンドを選択します。「データパッドに追加 &#39;。次に、マクロを選択：マクロコマンドを繰り返しを開始します。表示される繰り返し回数ウィンドウは9に設定してください。 </li><li>コマンドを選択します。「次を検索」。コマンドを選択します。「データパッドに追加 &#39;。最後に、マクロコマンドと終了を繰り返しを選択します。 <ol><li>今マクロを選択して録音を停止。動物番号の後にマクロを保存し、名前を付けます。注：各動物のためのマクロを設定するには、マクロは、長手方向の研究のために使用することができますし、時間を節約できます。 </li></ol></li><li>マクロは、現在、各コメントの間にインスピレーション（のT i）および有効期限（T eは ）時間を取得するために実行することができます。データは、データパッドのチャンネル1の下に表示されます。有効期限とインスピレーションが連続発生し、データは、この順序で表示されます。 <ol><li>データは手動で吸気と呼気の値に分割する必要がある。平均T iおよびT 電子メールを取得するために各パラメータの4つのデータ値を平均する。 </li></ol></li><li>プライマリ値が導出されると一回換気量（V T、ml）を計算することができる。一回換気量を得るためにDrorbaughとフェン8の式が使用されます。 V T（ミリリットル）=（P T / P K）×（V K）×（（T CORE（P B - P C））/（T CORE（P B - P C） - T、C（P B - P CORE））） どこ V T：換気量 P kは ：1ミリリットルの各注入による圧力の振れ（2.5ステップを参照してください） T コア ：各動物の中核温度 P C：茶における室温度X相対湿度での水の蒸気圧mber T C：動物室の温度 P コア ：体温で圧力（体温で水蒸気圧×1.0） P tは各一回換気量による圧力たわみ V K：キャリブレーションのための容量注入 P Bは ：気圧の圧力 </li><li>一回換気量が計算されると、以下のパラメータも決定することができる。 <ul><li>分容量（ml /分）= V T XF </li><li>分容量（ml /分/ kg）=（V T XF）/本体重量（kg） </li><li> V T（ミリリットル/キログラム）= V T（ミリリットル）/本体重量（kg） </li><li>吸気デューティ·サイクル（％）= T I / T TOT </li><li>吸気流量（ミリリットル/秒）= V T / T iは </li><li>吸気時間と呼気時間の時間の比率= T I / T E </li><li>全サイクル時間（秒EC）=インスピレーション時間（秒）+有効期限（秒） </li></ul></li></ol>

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The authors declare that they have no competing interests. The authors have no conflicts to disclose.

ここで説明する技術は、非拘束および無麻酔のマウスの呼吸パラメータの評価のための非侵襲的方法である。このプロトコルの長所は、最小限の人工物で縦方向に肺機能を測定するために、そのシンプルさと精度が含まれています。いくつかの制限と手続きについて記載すべき重要なステップは、しかし、があります。第一に、そして最も重要なのは、マウスが5秒以上室内に落ち着いている...

肺機能障害は、世界で罹患率および死亡率の主要な原因の1つである。条件は咳、胸の痛みや呼吸困難の代名詞不十分な酸素交換、ことを特徴としている。世界的な死亡率1〜10％のための呼吸器疾患を占めている。世界保健機関によると、死亡率に起因永続的な喫煙、汚染および職業的刺激物に上昇するように設定されている。 UWBP強く2を分析し、従来の生化学的および組織学的を補完する肺の生理機能を研究するための有用な付加である。肺の評価のために使用される他の手順はUWBPと同じ利点を提供しない。侵襲プレチスモは、動物が3,4麻酔されるので、結果として呼吸測定は、必ずしも自然な状態を反映していない必要があり、一般的に使用される技術である。さらに、機械的な換気および化学的な課題のための必要条件は、将来の測定値3,4を排除する。呼吸データを収集する別の方法は、UWBP 5と比較して、呼吸パラメータの細かい変化に敏感で強制振動によるものである。強制振動は、しかし、侵襲的技術であり、データ収集5-7の動物の終端を必要とする。 UWBPは、特殊なチャンバー内に動物を配置することを含む。吸気の間、呼気が暖められると水蒸気圧の上昇、肺内の加湿ガス8の熱膨張を引き起こす。この効果は、プレチスモグラフ室8内の圧力の上昇を作成する風量の純変化を引き起こす。反対は、動物からの呼吸波形を生成する呼気中に発生します。波形解析は、その後、呼吸トレースから測定するために使用される：呼吸数（呼吸/分）、全呼吸サイクル時間（秒）、吸息/呼気時間チタン（Ti / Teを、秒）により、各一回換気量（Pに圧力の変化T）。 <stroNG&gt;図1は、呼吸器トレースからそれぞれの測定値の原点を示しています。これらの測定は、計算が簡単で、複数の呼吸パラメータは、これらの測定値から導出することができる。これらのパラメータは次のとおりです。一回換気量（空気の体積が通常の吸気と呼気との間を移動）、分量（毎分、肺から吸入されるガスの体積）、吸気デューティ·サイクル（総呼吸サイクルの持続時間に吸気時間のパーセンテージ）と吸気流量（所定の時間内に吸入された空気の量）。 UWBPは、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供し、呼吸器疾患および肺機能6,9の進行を測定するために使用することができる。他の容積脈波法に反して、UWBPは、麻酔、拘束や工芸品と実験変動6,9を生成する侵襲的な操作の使用を回避する。麻酔は、呼吸を抑制することができる心拍数を変化させ、10を制御するために挑戦することができる。拘束は、コルチコステロンおよびエピネフリンリリース11,13経由による追加的なストレスに呼吸の増加を誘導する。 UWBPの重要な特徴は、長期的な研究には、影響を受けやすいこと、生理的な評価を繰り返される。 UWBP強く、肺生理学の長手方向の評価のために推奨され、将来の呼吸の薬剤の査定のための貴重なスキルを提供しています。 ブレオマイシン、オボアルブミン、および低酸素症は、いくつかの研究において、呼吸課題を誘導するために利用されているとUWBPが正常に正確な肺の生理学的な評価7,9,13-16を測定している。記載されたプロトコルは、標準的な成人の実験マウス用に設計されている。しかし、UWBPは、ラット、モルモット、および非ヒト霊長類17-20などの他の動物に適応されている。 UWBPは、肺機能不全の評価に限定されるものではなく、肺の成熟3の評価のために使用されてきた。UWBPの汎用性、シンプルさと再現性が動物で肺機能を評価するための優れた手法を確立した。さまざまなソフトウェアが（資機材の表を参照）、この手順に従うことが要求されます。経験豊かな科学者は、1時間以内に、マウスでは、このプロトコルを実行することができるであろう。

<table><tbody><tr><td>LabChart 7 software (for Macintosh)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>MLU60/7</td><td>used in protocol step 4</td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 (model ML870)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Octal Bridge Amp (model ML228)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>Black BNC to BNC cable (1 m)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>Macintosh OS</td><td>Apple Inc.</td><td></td><td>Mac OS X 10.4 or later</td></tr><tr><td>Surgipack Digital Rectal Thermometer</td><td>Vega Technologies</td><td>MT-918</td><td></td></tr><tr><td>Grass volumeteric pressure transducer PT5A</td><td>Grass Instruments Co.</td><td>Model number PT5A; serial No. L302P4.</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological syringe pipettes</td><td>Greiner Bio One</td><td>606160</td><td>Connected via plastic tubing</td></tr><tr><td>Balance/Scales</td><td>VWR International, Pty Ltd</td><td>SHIMAUW220D</td><td>Any weighing balance with of 0.1 gram resolution</td></tr><tr><td>HM40 Humidity &amp;amp; temperature meter</td><td>Vaisala</td><td>HM40A1AB</td><td></td></tr><tr><td>Barometer</td><td>Barometer World</td><td>1586</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory tubing</td><td>Dow Corning</td><td>508-101</td><td>Used to connect water column to the syringe and pressure transducer</td></tr><tr><td>Cylindrical Perspex Chamber</td><td>Dynalab Corp.</td><td></td><td>Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter.</td></tr><tr><td>80% Ethanol (4 L)</td><td>VWR International, Pty Ltd</td><td>BDH1162-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography

呼吸機能障害は、世界での罹患率および死亡率の主要な原因の一つであり、死亡率は上昇し続けている。げっ歯類モデルにおいて肺機能の定量的評価は、今後の治療法の開発における重要なツールである。一般的に侵襲容積脈波と強制振動を含む呼吸機能を評価するための技術を使用していました。これらの技術は貴重な情報を提供するが、データ収集に起因麻酔および/または動物の侵襲的な計測のための必要性にアーチファクトおよび実験的変動性を伴うことができる。これとは対照的に、拘束されていない全身プレチスモグラフィー（UWBP）は呼吸パラメータを分析することで、正確な、非侵襲的、定量的な方法を提供しています。この技術は、従来のプレチスモグラフィー技術に共通で麻酔し、拘束の使用を回避する。このビデオでは、機器のセットアップ、キャリブレーションおよび肺機能の記録を含むUWBP手順を紹介します。それ収集したデータを分析するだけでなく、動物の動きに起因する実験的な外れ値や工芸品を特定する方法を説明します。この技術を用いて得られた呼吸パラメータは一回換気量、分容積、吸気デューティサイクル、吸気流量及び呼気時間を吸気時間の比率を含む。 UWBPは専門的なスキルに依存しており、実行するのに安価ではありません。潜在的なユーザーにとって最も魅力的なキーUWBPの特徴、そして、同じ動物で肺機能の反復測定を実行する機能である。

この手順が正しく実行されたときに、一貫性のある振動トレースデータ分析ソフトウェアで作成される。手順は、リストされた呼吸パラメータを決定するために、簡単な計算の計算を使用してセットアップした後、数分以内に呼吸器のトレースを提供します。 図5対照（健常）マウスから、適切な呼吸トレースを表します。動物は活発に動いていないときに適切な振動データが生...

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Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

呼吸生理学の評価は、伝統的に、動物の拘束や鎮静を必要とする技術、に頼っています。非拘束全身プレチスモグラフィは、しかし、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供する。また、この技術は長期的な研究を可能にしたマウスの繰り返し呼吸評価を可能にする。

拘束されていない全身プレチスモグラフィを使用したマウスにおける呼吸機能の測定

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

measuring-respiratory-function-mice-using-unrestrained-whole-body

Research

JoVE Journal

Biology

30.2K ビュー.  Monash Institute of Medical Research. 呼吸生理学の評価は、伝統的に、動物の拘束や鎮静を必要とする技術、に頼っています。非拘束全身プレチスモグラフィは、しかし、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供する。また、この技術は長期的な研究を可能にしたマウスの繰り返し呼吸評価を可能にする。 

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

生物学

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

アレルゲン誘発性喘息のマウスモデル

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

免疫・感染学

Method to Obtain Pattern of Breathing in Senescent Mice through Unrestrained Barometric Plethysmography

Unrestrained barometric plethysmography (UBP) is a method for quantifying the pattern of breathing in mice, where breathing frequency, tidal volume, and minute ventilation are routinely reported. Moreover, information can be collected regarding the neural output of breathing, including the existence of central apneas and augmented breaths. An important consideration for UBP is obtaining a breathing segment with a minimal impact of anxious or active behaviors, to elucidate the response to breathing challenges. Here, we present a protocol that allows for short, quiet baselines to be obtained in aged mice, comparable to waiting for longer bouts of quiet breathing. The use of shorter time segments is valuable, as some strains of mice may be increasingly excitable or anxious, and longer periods of quiet breathing may not be achieved within a reasonable timeframe. We placed 22 month-old mice in a UBP chamber and compared four 15 s quiet breathing segments between minutes 60&#8211;120 to a longer 10 min quiet breathing period that took&#160;2&#8211;3 h to acquire. We also obtained counts of central apneas and augmented breaths prior to the quiet breathing segments, following a 30 min familiarization period. We show that 10 min of quiet breathing is comparable to using a much shorter 15 s duration. Additionally, the time leading up to these 15 s quiet breathing segments can be used to gather data regarding apneas of central origin. This protocol allows investigators to collect pattern-of-breathing data in a set amount of time and makes quiet baseline measures feasible for mice that may exhibit increased amounts of excitable behavior. The UBP methodology itself provides a useful and noninvasive way to collect pattern-of-breathing data and allows for mice to be tested over several time points.

Unrestrained barometric plethysmography is used to quantify the pattern of breathing in awake mice. We show that 15 s segments under a standardized protocol display similar values to an extended duration of quiet breathing. This methodology also allows for the quantification of apnea and augmented breaths during the first hour in the chamber.

非拘束的な圧膜検査を通じた老化マウスの呼吸パターンの取得方法

Unrestrained barometric plethysmography (UBP) is a method for quantifying the pattern of breathing in mice, where breathing frequency, tidal volume, and ...

行動学

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

気道抵抗測定とマウスにおける気管支肺胞洗浄液のサンプリングのためのリバーシブル、非侵襲的方法

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

神経筋疾患のマウスモデルにおいて呼吸筋活動および換気の繰り返し測定

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...

医学

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

ダブル室容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能の評価

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Simplified Whole Body Plethysmography to Characterize Lung Function During Respiratory Melioidosis

Surrogate animal models of disease are subject to the 3Rs of Responsible Research. There is a frequent revisiting of refinements to animal models to ensure that both animal welfare and scientific insights advance with the availability of new technologies. This article demonstrates the use of Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) to non-invasively study respiratory failure in a model of lethal respiratory melioidosis. sWBP has the sensitivity to detect breathing in mice through the entirety of the course of the disease, allowing for the moribund-associated symptoms (bradypnea and hypopnea) to be measured and potentially used to develop humane endpoint criteria.
Some of the benefits of sWBP in the context of respiratory disease are that host breath monitoring comes the closest of any physiologic measurement at assessing dysfunction of the primary infected tissue, namely, the lung. In addition to biological significance, the use of sWBP is rapid and non-invasive, minimizing stress in research animals. This work demonstrates the use of in-house sWBP apparatus to monitor disease throughout the course of respiratory failure in the murine model of respiratory melioidosis.

This protocol presents the construction and use of a Simplified Whole Body Plethysmography apparatus to monitor bacterial respiratory disease progression non-invasively.

呼吸性類鼻疽症中の肺機能を特徴付けるための簡略化された全身プレチスモグラフィ

Surrogate animal models of disease are subject to the 3Rs of Responsible Research. There is a frequent revisiting of refinements to animal models to ...

マウスの咳過敏症に対する非侵襲的リアルタイム全身プレチスモグラフィー

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

著者スポットライト:慢性咳嗽の病態生理学の調査

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

マウスにおける咳嗽および気道炎症の検出方法

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...