提示されたプロトコルは、環境中に長期間存在する可能性のあるトランスおよび多世代効果に関する研究を促進する。私たちは、トランスと多世代効果の研究に時間と労力を節約するために、雌雄同体として99.5を持つ自由に生きている線虫を採用しました。この技術は、本プロトコルの線虫が人間と多くの保守的なメカニズムまたは経路を共有するため、末端薬物の長期的な影響を実証するために使用することができる。
この方法は、化学物質の潜在的な危険のフィードバックを必要とするため、医薬品合成および環境管理の分野に関する洞察を提供することができます。この方法は、水生毒性に焦点を当てたダフニアマグナに適用することができます。また、ドロスフィラメラノガスターは、さらにジェンダーへの影響を探求します.
彼または彼女は、世代を超えて効果を研究することは時間とエネルギーを消費するという考えに固執するでしょう。第一印象で怖がらないでください。プロトコルに従うと、あなたに実りある結果が得られます。
大腸菌を培養するために、細菌懸濁液から200マイクロリットルのピペットをフラスコ中のLB培地50ミリリットルにする。または、インノキュリンループを使用してNGM寒天から小さなコロニーを選び、LB培地に入れる。C.elegansを培養するには、顕微鏡下で、先に調製した積層NGM寒天に線虫を数える。
数が2,000に近づくと、無菌チップを使用してNGM寒天の1/6をカットし、細菌の芝生で新しく準備されたNGM寒天に移します。その後の培養のために、NGM寒天体を22°Cのインキュベーターで逆さまにしてください。約36時間後、線虫はグラビドになる。
無菌の線虫と新しく生産された卵を滅菌遠心管に洗い流すために2ミリリットルの無菌水を使用してください。チューブをラックに30分間置いて線虫を落ち着かせ、ピペットで上澄みの85%を捨てます。線虫が同期に十分なグラビドであるかどうかを判断することは非常に重要です。
それ以外の場合、経過時間同期の操作は無駄になります。ペレットを7巻の次亜塩素酸ナトリウム溶液と混ぜ、遠心分離管を2分ごとに5~8回振り、幼虫と成体線虫を溶かします。チューブを摂氏20度で3分間Gの700倍にして、ピペットで上清を捨てます。
ペレットを5巻の無菌水で再中断し、加齢に合わせた卵を洗います。摂氏20度で3分間、Gの700倍の遠心分離機。滅菌水で洗浄を2回繰り返します。
次に、チューブに1ボリュームの無菌水を加え、年齢同期卵を再び懸濁させます。細菌の芝生を持つ各新しいNGM寒天に50マイクロリットルをピペットすることによって卵の懸濁液を配布します。NGM寒天の上面を摂氏20度のインキュベーターに30分間上げておき、水が蒸発したり、細菌の芝生に吸収されたりします。
その後、NGM寒天をひっくり返し、逆さまに、その後の培養のために、卵の時間として時間をマークします。卵の時間の36時間後、線虫はL3幼虫の段階に達する。2ミリリットルの無菌水を使用して、各NGM寒天を遠心管に洗い流します。
30分間沈降した後、上清の85%をK Mediumに置き換え、腸内の食品を2時間消化します。その後、上清を捨てます。K Mediumを使用して、その後の実験のために線虫懸濁液を100マイクロリットル当たり約200線虫に調整します。
エッジ効果を避けるために、96ウェル無菌マイクロプレートの中間領域で、調製された制御または化学溶液の100マイクロリットルを10ウェルに加え、6つのグループで複製します。60個のウェルのそれぞれに、準備した線虫K培地の100マイクロリットルを加えます。時間を T0 としてマークします。24~96時間の露光を行います。
露光後、ピペットを使用して、各グループの5つの井戸から6つの1.5ミリリットル遠心管に線虫を収集します。線虫を30分間落ち着かせ、ピペットを入れ、上清を捨てます。底部の線虫を1ミリリットルの殺菌水で洗います。
線虫を30分間落ち着かせる。上清を捨て、F0とマークされた露出した親生成の指標測定に下部の線虫を使用します。各グループの残りの5つの井戸から線虫を収集します。以前のように線虫を落ち着かせ、洗います。
次に、100マイクロリットルの無菌水を加えて各チューブ内の線虫を再中断し、線虫の懸濁液を細菌の芝生を備えた3つの新しく調製されたNGM寒天に均等に移します。線虫を36時間インキュベートしてグラビドになり、以前のように年齢同期を行います。NGM寒天に同期した卵を細菌の芝生で36時間インキュベートした後、線虫を6つの遠心管に洗い流します。
1ミリリットルの滅菌水で沈降して洗浄した後、T1とマークされた子孫の指標測定のために底部の線虫を使用します。1ミリリットルの制御または化学溶液と暖かいNGM寒天の99ミリリットルを混合します。原稿に従って細菌懸濁液で寒天を準備した後、バイオセーフティキャビネットで、シャーレの上蓋を脇に置き、細菌の芝生を15分間紫外線にさらす。紫外線処理された寒天に年齢同期卵をピペット。
親世代へのエクスポージャーの開始 F0 をゼロ日としてマークします。摂氏20度で3日間寒天をインキュベートします。次に、成熟した線虫を使用してF0の効果を測定する。また、3日目には、リングに曲げた人工繊維線を取り付けたガラス棒を使用してF0成熟した線虫を選び、新しいUV処理NGM寒天の表面にスライドさせます。
4日目に、NGM寒天から成熟したF0線虫を選んで捨てます。6日目には、3日間の露出を経験したF1成熟した線虫を使用してインデックス測定を行います。このプロトコルにおいて、体曲げ頻度に対するカドミウム、銅、鉛、および亜鉛の世代間過効果は、ネマトード親F0の阻害が出生前暴露後の子孫T1よりも少ないことを示した。スルファメトキサゾールの多世代残留効果が線虫類の寿命および生殖に及ぼす影響は、生殖が生殖線曝露において著しく影響を受け、T3からT6世代までの非暴露世代において毒性が持続することを示した。
多世代暴露と線虫生化学および遺伝的指標に対するリンジンの多世代の残留効果は、インスリンシグナル調節の障害を伴う肥満作用を示した。さらに、sgk-1とakt-1シグナル伝達の間の変化は、異なる暴露世代からの線虫が許容および回避に対して異なる応答戦略を示すことを示した。各操作の前に線虫の生きている状態を確認し、それに応じて次の手順を変更します。
他の効果は、例えば、化学物質の肥満作用、さらに何世代にもわたって肥満の増加の有病率に答えるために含めることができる。この方法に基づいて、さらなるメカニズムを探索することができる。例えば、遺伝性エピジェネティックなシグナルは世代間で起きます。
塩素溶液は強い酸化電位を有し、それに皮膚の直接接触を避ける。
