وسييسر البروتوكول المقدم إجراء دراسات عن الآثار المتعددة الأجيال للبروتينات التي يمكن أن توجد لفترة طويلة في البيئة. استخدمنا النيماتودا الحية الحرة مع 99.5 كما hermaphrodites لتوفير الوقت والجهد في دراسة الآثار عبر والأجيال المتعددة. ويمكن استخدام هذه التقنية لإثبات الآثار الطويلة الأجل للأدوية النهائية لأن الخيط من الخيط في البروتوكول الحالي يشترك في العديد من الآليات أو المسارات المحافظة مع البشر.
ويمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة لميادين التوليف الصيدلاني والإدارة البيئية لأنهم بحاجة إلى تغذية مرتدة عن المخاطر المحتملة للمواد الكيميائية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على ماغنا Daphnia مع التركيز أكثر على السمية المائية. أيضا Drosphila melanogaster لمزيد من استكشاف التأثير على نوع الجنس.
سيكون عالقاً بفكرة أن دراسة الآثار على مر الأجيال تستغرق الوقت والطاقة. لا تخافوا في الانطباع الأول. وبعد البروتوكول سوف تكسب لك نتيجة مثمرة.
إلى ثقافة E.coli، ماص 200 ميكرولترات من التعليقات البكتيرية إلى 50 ملليلتر من متوسطة LB في قارورة. أو استخدام حلقة تلقيح لاختيار مستعمرة صغيرة من ngm agars ووضعها في المتوسط LB. إلى ثقافة [ك.] [إلغنس], تحت مجهر, عدّ ال [نماتودس] على التراص NGM [أغرس] أعدت في وقت سابق.
عندما يصل العدد إلى ما يقرب من 2،000، واستخدام طرف معقمة لخفض 1/6 من أجار NGM ونقلها إلى Agars NGM أعدت حديثا مع الحديقة البكتيرية. الحفاظ على NGM agars رأسا على عقب في حاضنة درجة مئوية 22 للثقافة اللاحقة. بعد حوالي 36 ساعة، تصبح الديدان الخيطية جرافيد.
استخدام مليلترين من الماء المعقم لطرد الديدان الخيطية الخضراء والبيض المنتجة حديثا على كل NGM أجار في أنابيب الطرد المركزي العقيمة. ضع الأنابيب على رف لمدة 30 دقيقة ليستقر على الديدان الخيطية ، ثم تخلص من 85٪ من المنابس عن طريق الأنابيب. من المهم جداً الحكم على ما إذا كانت الديدان الخيطية هي غرافيد بما فيه الكفاية للتزامن.
وإلا فإن عملية تزامن العمر ستذهب سدى. اخلط الكريات مع سبعة مجلدات من محلول هيبوكلوريت الصوديوم واهتزاز أنابيب الطرد المركزي كل دقيقتين لمدة خمس إلى ثماني مرات لتزويج اليرقات والنيماتودا البالغة. الطرد المركزي الأنابيب في 700 مرة G لمدة ثلاث دقائق في 20 درجة مئوية ومن ثم التخلص من ابرونات عن طريق الأنابيب.
إعادة تعليق الكريات في خمسة كميات من الماء المعقم لغسل البيض العمرية متزامنة. أجهزة الطرد المركزي في 700 مرة G لمدة ثلاث دقائق في 20 درجة مئوية. كرر غسل عن طريق الماء المعقم، مرتين.
بعد ذلك، أضف كمية واحدة من الماء المعقم إلى الأنابيب لإعادة تعليق البيض المتزامن مع العمر. توزيع تعليق البيض عن طريق pipetting خمسون لتراً من اللترات الدقيقة على كل ngm agars جديدة مع الحديقة البكتيرية. الحفاظ على اغار NGM الجانب العلوي في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، مما يسمح للمياه لتتبخر أو يمكن امتصاصها من قبل الحديقة البكتيرية.
ثم، تسليم أجار NGM، رأسا على عقب، للثقافة اللاحقة، ووضع علامة على الوقت كما وقت البيض. بعد 36 ساعة من وقت البيض ، تصل الديدان الخيطية إلى مرحلة يرقات L3. استخدام مليلترين من الماء المعقم لطرد الديدان الخيطية قبالة كل NGM أجار في أنابيب الطرد المركزي.
بعد تسوية لمدة 30 دقيقة، استبدال 85٪ من االاهبات مع K المتوسطة لهضم الطعام في الشجاعة لمدة ساعتين. ثم، تجاهل اابر. استخدام K المتوسطة لضبط تعليق الديدان الخيطية إلى حوالي 200 nematodes لكل 100 ميكرولترات للتجارب اللاحقة.
لتجنب آثار حافة، في المنطقة الوسطى من 96 جيدا معقمة microplate، إضافة 100 ميكرولترات من التحكم المعد أو الكيميائية الحلول في 10 آبار، كما يكرر في ست مجموعات. إضافة 100 ميكرولترات من الديدان الخيطية المعدة K المتوسطة لكل من الآبار 60. وضع علامة على الوقت على أنه T0. إجراء التعرض لمدة 24 إلى 96 ساعة.
بعد التعرض، استخدم ماصة لجمع الديدان الخيطية من خمسة آبار في كل مجموعة، في ستة أنابيب للطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر. تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة ثم ماصة لتجاهل super. غسل الديدان الخيطية في الجزء السفلي مع ملليلتر واحد من المياه المعقمة.
تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة. تجاهل المنابس، واستخدام الديدان الخيطية في الجزء السفلي لقياسات المؤشرات للجيل الأصلي المكشوف، الذي تم تمييزه على أنه F0. جمع الديدان الخيطية من الآبار الخمسة المتبقية في كل مجموعة. تسوية وغسل الديدان الخيطية كما كان سابقا.
بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من المياه المعقمة لإعادة تعليق الديدان الخيطية في كل أنبوب، ونقل تعليق الخيطية بالتساوي على ثلاثة NGM agars أعدت حديثا مع الحديقة البكتيرية. احتضان النيماتودا لمدة 36 ساعة لتصبح gravid، وأداء تزامن العمر، كما كان سابقا. بعد احتضان البيض المتزامن على ngm agars مع الحديقة البكتيرية لمدة 36 ساعة ، قم بتدفق الديدان الخيطية في ستة أنابيب طرد مركزي.
بعد تسوية وغسل مع ملليلتر واحد من المياه المعقمة، واستخدام الديدان الخيطية في الجزء السفلي لقياسات مؤشر من جيل ذرية وضعت عليها T1. مزيج 99 ملليلتر من أجار NGM دافئ مع ملليلتر واحد من السيطرة أو الحلول الكيميائية. بعد إعداد الاجارات مع تعليق البكتيريا وفقا للمخطوطة، في مجلس الوزراء السلامة الحيوية، جانبا الأغطية العليا من أطباق بتري ويعرض الحديقة البكتيرية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. الماصات البيض متزامنة العمر على أجار الأشعة فوق البنفسجية المعالجة.
وضع علامة على بداية التعرض للجيل الأصل F0، كـ اليوم صفر. احتضان أجار لمدة ثلاثة أيام في 20 درجة مئوية. ثم، استخدام الديدان الخيطية ناضجة لقياس الآثار في F0. أيضا، في اليوم الثالث، واستخدام قضيب زجاجي مزودة سلك الألياف من صنع الإنسان عازمة في حلقة لاختيار النيماتودا ناضجة F0، والانزلاق على سطح جديد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية NGM agars.
في اليوم الرابع، اختر وتجاهل النيماتودا F0 الناضجة من NGM agars. في اليوم السادس، استخدم النيماتودا الناضجة F1 التي تعرضت للتعرض لمدة ثلاثة أيام لقياس المؤشرات. في هذا البروتوكول، أظهرت الآثار عبر الأجيال من الكادميوم والنحاس والرصاص والزنك على تردد الانحناء الجسم أن الموانع في الأم الخيطية، F0، بعد التعرض قبل الولادة كانت أقل مما كانت عليه في ذريتها، T1. وأظهرت الآثار المتبقية المتعددة الأجيال من السلفاميتوكسيزول على عمر الخيط والتناسل أن التكاثر قد تأثر بشكل كبير في التعرض للخط الجرثومي، واستمرت سمياتها في الأجيال غير المعرضة من الجيلين T3 إلى T6.
وقد أظهر التعرض المتعدد الأجيال والآثار المتبقية لليندين على المؤشرات الكيميائية الحيوية والوراثية للنيماتودا آثاراً بدانة مع اضطرابات في تنظيم إشارة الأنسولين. وعلاوة على ذلك، فإن التغييرات بين إشارة sgk-1 و akt-1 تشير إلى أن النيماتودا من مختلف أجيال التعرض أظهرت استراتيجيات استجابة مختلفة للتسامح والتجنب. تحقق من الحالة المعيشية للنيماتودا قبل كل عملية، وتعديل الخطوات التالية وفقا لذلك.
ويمكن إدراج آثار أخرى، على سبيل المثال، آثار بدانة المواد الكيميائية، لمزيد من الإجابة على زيادة انتشار السمنة على مر الأجيال. واستنادا إلى هذه الطريقة، يمكن استكشاف المزيد من الآليات. على سبيل المثال، إشارات اللاجينية القابلة للتهيّد بين الأجيال.
حلول الكلور لديها إمكانات قوية المؤكدة، وتجنب الاتصال المباشر من الجلد لذلك.
