免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

現在、免疫組織化学は、特定の分子マーカーの存在および病理の場合の変化を特定するために頻度を増加させるとともに使用され、定量的分析を行う可能性に根を下ろしています。免疫体化学は、主に免疫蛍光技術が幼虫および成体ゼブラフィッシュ動物モデルに使用されるが、ゼブラフィッシュの良い標準免疫体化学プロトコルについてはほとんど知られていない。ここでは、成体ゼブラフィッシュの重要なタンパク質の進化的保存を研究するために使用できるプロトコルを説明し、説明する。

成体ゼブラフィッシュの免疫組織化学のための良いプロトコルは、高度に保存された生体分子の形態学的発現および分布を研究するために、この動物モデルの有用性の根源となる可能性がある。この方法はまた、ヒト生理病理学と相関する病理学的状態によるこれらの生体分子の変化の可能性を分析するのに役立つ。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるリー・チュニシ博士です。

この手順を開始するには、調製した凍結組織ブロックをマイナス20°Cのクライオスタットに移します。10マイクロメートルのコロナまたは矢状のセクションでブロックをカットします。次に、免疫組織化学に適した接着ガラススライドに代替シリアルセクションの組織を収集し、進む準備ができるまでマイナス20°Cで保管します。

まず、溶剤耐性ペンを使用して、スライド上の組織領域を区切ります。0.1モルリン酸緩衝液を使用して、各5分間に3回ずつセクションをすすいします。次に、トリトンX-100の0.3ミリリットルを0.1モルリン酸緩衝バッファーの100ミリリットルに溶解し、0.3%トリトンX-100を含むリン酸緩衝液中に0.1%正常ロバ血清を溶解してブロッキング溶液を調製する。

透過性バッファーPB-Triton X-100 0.3%に溶解した正常ロバ血清の溶液を用いて切片を室温で30分間インキュベートし、細胞膜を透過させ、非特異的結合部位を遮断する。まず、0.1モルリン酸緩衝液で各5分間、セクションを3回リンスします。PB-Tで希釈した一次抗体の混合物を加え、室温で湿気の多い箱に一晩切片をインキュベートする。

翌日、0.1モルリン酸緩衝液でそれぞれ5分間、セクションを3回リンスします。PB-Tで希釈した二次抗体の適切な混合物で2時間室温で切片をインキュベートする。まず、セクションを3回5分間に3回リンスし、それぞれ0.1モルリン酸緩衝液を使用します。

1.5マイクロリットルのDAPIを3ミリリットルのリン酸バッファーに溶解し、核染料DAPIを調製します。染料のセクションに対抗します。次に、取り付け媒体を使用してスライドをカバースリップし、組織を安定させ、長期間使用するために汚れをする。

蛍光サンプルは摂氏4度で暗闇の中に貯蔵することができる。免疫蛍光プロトコルを繰り返し、一次または二次抗体を省略するか、一次または二次抗血清をリン酸緩衝液に置換して陰性対照を調製する。次に、免疫蛍光プロトコルを繰り返し、各一次抗体を過剰の相対ペプチドで事前吸収する。

マウス脳のスライスに免疫蛍光プロトコルを繰り返し、陽性制御を準備します。X-Y-Zモーター化ステージを搭載した共焦点顕微鏡、デジタルカメラ、取得・解析ソフトウェアを用いて、免疫染色部を観察・解析します。5倍、20倍、40倍の目標を持つデジタル画像を取得します。

各チャンネルで各セクションの画像を低倍率で撮影し、低倍率のモンタージュを構成します。蛍光画像を最大コントラストとオーバーレイに正規化します。関心のある領域全体で、1〜1.8マイクロメートルの焦点ステップを持つ6つの焦点面を通して画像のシリアルZスタックを収集します。

このコレクションは、チャネルごとに個別に実行します。その後、イメージデコンボルケーションソフトウェアを使用して、10回の反復を適用して画像をデコンし、シリアルZプレーン画像を単一の最大投影画像に集約します。適切な画像編集ソフトウェアを使用して、光とコントラストのマイクログラフを調整します。

成人ゼブラフィッシュの腸内におけるOX-AおよびOX-2R分布の免疫学的分析は、OX-AおよびOX-2Rの異なる局在部位およびDIOゼブラフィッシュの腸内細胞における発現の増加を示す。OX-Aの強烈な褐色染色は、内側および前腸の細胞で観察される。OX-Aの免疫発現は、異なる腸内の明確なシグナルを与え、前部から内側腸に向かって減少する。

同様の結果は、DIOおよびコントロール食ゼブラフィッシュの腸内のOX-2R免疫発現について観察される。DIO成体ゼブラフィッシュにおけるOX-Aシグナルの増加は、他の腸内のOX-2Rの過剰発現を伴う。免疫蛍光画像の正確な分析は、対照食ゼブラフィッシュと比較して、DIO成体ゼブラフィッシュの腸内でのOX-2R/CB1R共局在の増加を示しています。

同様の状況は、例えば、後頭脳、視床下部、視状骨、トーラス・ラテラリス、および下葉のびまん核のような異なる脳領域で観察される。オレキシンAとCB1Rの共局在化を伴う二重免疫染色により、視床下部のオレキシンニューロンにおける共局在化の増加が見られ、オレキシンA蛍光シグナルの増加を伴う。これらの結果は、二重免疫蛍光が、生理学的に保存されたタンパク質発現、標的タンパク質の共局在化、およびそれらの分布および/または異なる病理学的状態における発現変化を同定するのにどのように役立つかを示している。

免疫蛍光を用いれば、生体分子の共分布と共発現、相互作用の可能性をよりよく理解することができ、異なる病理の場合の変化の目に見えるイメージを持つことができます。さらに、代謝酵素発現または受容体の神経解剖学的分布は、組織内のタンパク質シグナル伝達の役割をさらに明らかにすることができる。本技術研究では、成人ゼブラフィッシュモデルを用いて、2つの高度に保存されたシステムであるオレキシンとエンドカンナビノイドを研究するための免疫蛍光アプローチを導入した。

ここで説明したこのプロトコルを使用して、成体ゼブラフィッシュの脳で初めて、オレキシン-2受容体の解剖学的分布と共発現とエンドカンナビノイド-CB1受容体は決定されていない。我々は、免疫組織化学実験のために、そしてそれらの機能をよりよく理解するために、成体ゼブラフィッシュのペプチドの空間分布および受容体の組織化を検出するためにここに記載されているプロトコルを推奨する。