ナノプラズモン強化散乱(nPES)は、時間のかかる労力を要するエキソソーム浄化ステップをスキップし、外因性分析の臨床現場への応用を拡大することができる外科的生検に対する単純で非侵襲的な代替手段である。このnPESアッセイは、分離した分離および精製ステップを必要としないエキソソームの外膜上の特定のバイオマーカーを分析するための迅速な手順である。このアッセイには非常に小さな臨床サンプルしか必要としないです。
したがって、この方法は、遺伝子操作またはPDXマウスモデルの研究にnPESの使用を拡大することができます。このプロトコルには、困難に思えるいくつかの手順があります。しかし、いくつかの練習を行えば、基本的なウェットラボスキルを持つすべての人がnPESを正常に実行することを学ぶことができます。
手順を開始するには、NeutrAvidin機能性ゴールドナノロッドの懸濁液の40マイクロリットルを、200マイクロリットルの冷たいpH 7リン酸緩衝生理食塩水と組み合わせます。8500倍のgで摂氏4度で10分間遠心し、上清を取り除きます。この洗浄プロセスをさらに2回繰り返し、ナノロッドを40マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁します。
次に、150マイクロリットルの冷たいPBSと10マイクロリットルの適切なビオチン化抗体の1ミリリットルの溶液を懸濁液に加えます。抗体コンジュゲートゴールドナノロッドを得るために2時間摂氏4度で混合します。冷たいPBSの200マイクロリットル部分を摂氏4度でそれぞれ10分間、6500倍の遠心分離でナノロッドを3回洗浄します。
その後、洗浄した抗体共役ナノロッドを200マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁し、最大24時間摂氏4度で保存します。スライドの準備を開始するには、PBSで1ミリリットル当たり025ミリグラムに所望のエキソソーム捕捉抗体を希釈します。この溶液のピペット1マイクロリットルは、光学グレードのガラスで裏打ちされたタンパク質A/ G処理スライドの各ウェルに入れられます。
その後、スライドを加湿ボックスに移し、インキュベーション中に井戸が乾燥しないようにします。キャプチャ抗体を固定するために、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。次いで、残りの溶液を吸引し、非結合抗体を除去する。
PBSを1マイクロリットルずつ3回加えて吸い出して井戸を洗います。次に、PBSベースのブロッキングバッファーを1マイクロリットルずつ素早く各ウェルにロードし、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。15個のサンプルを動かしている場合、ブロッキング剤の蒸発を避けるために、ブロッキングバッファを5分以内で120の井戸にロードするために、単一チャネルのピペットを使用する必要があります。
スライドブロッキング中に抗体コンジュゲートゴールドナノロッドの溶液の調製を開始します。ブロッキングが終了する約30分前に、室温の水浴中の血漿または血清サンプルを急速に解凍する。30秒間解凍したサンプルをボルテックスして、懸濁液が均質であることを確認します。
次いで、サンプルを500倍gで15分間遠心分離し、タンパク質凝集体および他の破片を沈殿させた。上清の10マイクロリットルのアリコートを新鮮なチューブに移し、PBSで1対1の希釈液を作ります。希釈したサンプルを、適宜穏やかな渦または反転によって混ぜます。
スライドブロッキングが終了したら、ブロッキングバッファーを吸引し、PBSの1マイクロリットルの部分でウェルを3回洗浄します。すぐに井戸あたり1マイクロリットルとサンプルあたり8つの複製で井戸にサンプルをロードします。同様に適切な井戸にエキソソーム標準をロードします。
スライドを摂氏4度の冷蔵庫で12~18時間インキュベートします。次いで、ウェルを吸引し、PBSを1マイクロリットルでそれぞれ1回よく洗う。抗体コンジュゲートゴールドナノロッド懸濁液を1マイクロリットルずつ各ウェルに積み込み、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。
その後、ナノロッド懸濁液を吸引し、1%ポリソルベート20を10分間ミキサーを用いてPBSでスライドを洗浄した。次いで、ウェルを吸引し、回転ミキサーで10分間脱イオン水でスライドを洗浄した。水を取り除き、スライドをきれいなペトリ皿で空気乾燥させてから、スライドを暗視野顕微鏡に持ち込みます。
暗視野油浸縮器、4xの目的およびモーター式の段階が装備されている逆の顕微鏡を置く。デジタルカメラで顕微鏡をコンピュータに接続し、イメージングソフトウェアを開きます。次に、サンプルスライドを顕微鏡ステージ上で上下逆さまに置き、凝縮レンズがスライドに接触するところに液浸油の小さな滴を塗布する。
画像ソフトウェアで顕微鏡を通してビューを表示します。高濃度標準によく照らされた時間を調整して、画像が飽和しないようにします。次に、大きな画像をスキャンするためのツールを開き、目的の倍率を10倍に設定します。
ステージの動きの間にアクティブなシャッターを閉じ、各キャプチャの前に20ミリ秒待つことを選択します。ステッチオーバーラップを20%に設定し、最適なパスを使用してステッチを選択します。スキャンから大きな画像を作成することを選択します。
スキャンの開始時にカメラが手動でフォーカスされるように設定し、20 フィールドごとに自動的にステップバイステップのフォーカスを有効にします。次に、ターゲットスキャンフィールドの左、右、上、および下の制限を設定し、顕微鏡ステージを所望の範囲のそれぞれに移動してスキャン領域を定義します。次に、焦点、凝縮器、および領域照明を調整して、明るく明るい画像を得る。
作成するイメージ ファイルに名前を付け、スキャンを開始します。完了したら、画像を開いて1/8スケールで保存します。画像解析ソフトウェアを開きます。
次に、[プラグイン] メニューを開き、[DSM スキャン] をクリックし、列と行の数を定義し、サイズ変更の割合を 25 に設定し、スポット直径をピクセル単位で 190 ~ 200 に設定し、直径の範囲を 32 に設定し、増分直径をピクセル単位で 8 に設定します。DSM の上限を 0 と 62 に、隣接する距離を 100 に、減算バイアスをゼロに設定します。DSM アルゴリズムを実行し、結果のデータを保存します。
DSM分析技術は、マイクロリットル当たり0.24~1.2マイクログラムの連続希釈PANC-1エキソソームサンプル全体で良好な再現性を示した。金ナノロッドからの散乱応答とエキソソームタンパク質濃度との間には強い線形相関が認められた。膵臓癌患者と健康な患者の間で癌関連バイオマーカーEphA2を発現する血清エキソソームの存在量に有意な差が認められた。
ブロッキング剤の添加以降、サンプルの蒸発を避け、クロスコンタミネーションを導入し、スライドの表面を傷つけるために、迅速かつ正確なピペット処理が重要です。この手順に従って、対象となるエキソソームバイオマーカーの発現と、研究されている疾患の異なる段階との間の相関関係を調べる統計解析を行う。この技術を確立した後、初期の膵臓癌の外生バイオマーカーを見つけることができます。
現在、この発見を他のタイプの癌や感染症に拡大しています。通常、このアッセイで取り扱うサンプルは、患者のサンプルまたは癌細胞株からの精製エキソソームサンプルのいずれかで、特別な安全トレーニングを必要とする。
