Nanoplasmon المعززة التشتت ، أو nPES ، هو بديل بسيط وغير باضع للخزعة الجراحية التي يمكن تخطي الوقت وكثيفة العمالة خطوات تنقية ، وتوسيع تطبيق تحليل الاحتقان إلى البيئات السريرية. هذا المقايسة nPES هو إجراء سريع لتحليل المؤشرات الحيوية محددة على الغشاء الخارجي من الكوسومات التي لا تتطلب منفصلة العزلة والتطهير الخطوات. نحتاج فقط إلى عينة سريرية صغيرة جداً لهذا الفحص
ولذلك، يمكن لهذه الطريقة توسيع استخدام nPES لدراسة نماذج الماوس أو PDX المعدلة وراثيا. هناك خطوات قليلة في هذا البروتوكول قد تبدو شاقة. ومع ذلك ، مع عدد قليل من الممارسة يدير ، يمكن للجميع مع المهارات الأساسية مختبر الرطب تعلم أداء بنجاح nPES.
لبدء هذا الإجراء، والجمع بين 40 ميكرولترات من تعليق نانورود الذهب نيوترافيردين وظيفية مع 200 ميكروليتر من البرد، وhh سبعة المالحة الفوسفات المخزنة. الطرد المركزي الخليط في 8500 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق، وإزالة فائقة. كرر هذه العملية غسل مرتين أكثر، ومن ثم إعادة تعليق nanorods في 40 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني الباردة.
بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترات من PBS البارد و 10 ميكرولترات من محلول 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة ذات الثنائية الحيوية المناسبة إلى التعليق. تخلط عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين للحصول على نانورود ذهبية مضادة مترافقة. غسل نانورود ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي في أجزاء 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة في 6500 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لكل منهما.
بعد ذلك ، resuspend نانورودس المضادة المترافقة المغسولة في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة ، وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. للبدء في إعداد الشريحة، تمييع الأجسام المضادة لالتقاط الإكسوسوم المرغوب فيها إلى 025 ملليغرام لكل ملليلتر في برنامج تلفزيوني. الماصات واحدة microlit من هذا الحل في كل بئر من شريحة بروتين A / G المعالجة مدعومة بالزجاج البصري الصف.
ثم، نقل الشريحة إلى مربع الترطيب لضمان الآبار لا تجف أثناء الحضانة. احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لشل الأجسام المضادة الالتقاط. ثم، الطامح الحل المتبقي لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة.
غسل الآبار عن طريق إضافة وpirating واحد ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. المقبل، تحميل بسرعة كل بئر مع ميكرولتر واحد من حاجز حظر برنامج تلفزيوني القائم على، واحتضان الشريحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. عند تشغيل حوالي 15 عينة، يجب علينا استخدام ماصة قناة واحدة لتحميل العازلة حظر على 120 آبار في أقل من خمس دقائق لتجنب تبخر عامل حجب.
بدء إعداد حل من الأجسام المضادة مترافق نانورود الذهب أثناء حجب الشريحة. حوالي 30 دقيقة قبل التشطيبات، تذوب بسرعة عينات البلازما أو المصل في حمام مائي درجة حرارة الغرفة. دوامة العينات المذابة لمدة 30 ثانية لضمان أن التعليقات متجانسة.
ثم، الطرد المركزي العينات في 500 مرة ز لمدة 15 دقيقة لتعجيل مجاميع البروتين وغيرها من الحطام. نقل 10 ميكرولتر aliquots من افرات إلى أنابيب جديدة، وجعل واحد إلى واحد التخفيف مع برنامج تلفزيوني. اخلط العينات المخففة عن طريق الدوامة اللطيفة أو الانقلاب حسب الاقتضاء.
عند انتهاء حظر الشريحة ، يُطرّق إلى المخزن المؤقت للحظر ويغسل الآبار ثلاث مرات بأجزاء صغيرة واحدة من PBS. قم بتحميل العينات على الفور في الآبار بم ميكرولتر واحد لكل بئر وثمانية نسخ متماثلة لكل عينة. تحميل معايير الاكسوس في الآبار المناسبة بنفس الطريقة.
احتضان الشريحة لمدة 12 إلى 18 ساعة في ثلاجة بأربع درجات مئوية. ثم، pirate الآبار، وغسل كل بئر مرة واحدة مع ميكرولتر واحد من برنامج تلفزيوني. تحميل ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة مترافق نانورود الذهب تعليق في كل بئر، وتحتضن الشريحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد ذلك، التعرق تعليق نانورود، وغسل الشريحة في برنامج تلفزيوني تكملها 1٪ بوليسوربات 20 لمدة 10 دقائق باستخدام خلاط. ثم، التعرق الآبار، وغسل الشريحة في المياه ديونيد لمدة 10 دقائق على خلاط الدورية. إزالة الماء، والسماح للشريحة لتجف الهواء في طبق بيتري نظيفة قبل جلب الشريحة إلى المجهر حقل الظلام.
إعداد مجهر مقلوب مجهزة مكثف الغمر النفط في الحقل المظلم، هدف 4x، ومرحلة آلية. قم بتوصيل المجهر بجهاز كمبيوتر عبر كاميرا رقمية، وفتح برنامج التصوير. ثم ضع الشريحة العينة رأسا على عقب على مرحلة المجهر، وتطبيق قطرة صغيرة من زيت الغمر حيث عدسة المكثف اتصالات الشريحة.
عرض طريقة العرض من خلال المجهر في برنامج التصوير. ضبط وقت التعرض ضد مستوى التركيز العالي جيدا لضمان أن الصورة لن تكون مشبعة. ثم افتح الأداة لمسح الصور الكبيرة، وقم بتعيين التكبير الهدف إلى 10x.
اختر إغلاق الغالق النشط أثناء حركة المرحلة والانتظار 20 مللي ثانية قبل كل التقاط. تعيين تداخل خياطة إلى 20٪ وحدد خياطة عبر المسار الأمثل. اختر إنشاء صورة كبيرة من الفحص.
قم بتعيين الكاميرا للتركيز يدويًا في بداية الفحص، وتمكين التركيز التلقائي خطوة بخطوة كل 20 حقلًا. ثم اختر تعيين الحدود اليسرى، اليمنى، العلوية، والسفلى لحقل المسح الهدف، ثم حدد منطقة المسح عن طريق نقل مرحلة المجهر إلى كل من الحدود المطلوبة. بعد ذلك، قم بضبط التركيز والمكثف وإضاءة المنطقة للحصول على صورة واضحة ومضاءة جيداً.
اسم ملف الصورة التي سيتم إنشاؤها، وبدء عملية المسح الضوئي. عندما ينتهي، فتح الصورة وحفظها في 1/8 مقياس. افتح برنامج تحليل الصور.
ثم افتح القائمة الإضافات، انقر فوق DSM Scan، وحدد عدد الأعمدة والصفوف، وقم بتعيين نسبة تغيير الحجم إلى 25، وقم بتعيين قطر النقطة، بالبكسل، إلى 190 إلى 200، وقم بتعيين نطاق القطر إلى 32، وتعيين قطر الزيادة، بالبكسل، إلى ثمانية. تعيين حدود DSM المنخفضة والعالية إلى صفر و 62، المسافة المجاورة إلى 100، والتحيز الطرح إلى صفر. تشغيل خوارزمية DSM وحفظ البيانات الناتجة.
أظهرت تقنية تحليل DSM قابلية جيدة للتكرار عبر عينات إكسوسومات PANC-1 المخففة بشكل متسلسل تتراوح بين 0.24 إلى 1.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر. ولوحظ وجود ارتباط خطي قوي بين استجابة التشتت من نانورود الذهب وتركيز البروتينات الإكسوسوم. لوحظ اختلاف كبير في وفرة إكسوس المصل التعبير عن العلامات البيولوجية المرتبطة بالسرطان EphA2 بين المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس والمرضى الأصحاء.
من إضافة عامل منع فصاعدا، الأنابيب سريعة ودقيقة أمر بالغ الأهمية لتجنب تبخر العينات، وإدخال التلوث المتبادل، وخدش سطح الشريحة. بعد هذا الإجراء ، نقوم بإجراء تحليل إحصائي للتحقيق في أي ارتباط بين التعبير عن العلامة الحيوية الإزومية ذات الاهتمام والمرحلة المختلفة من المرض الذي يتم دراسته. بعد إنشاء هذه التكنولوجيا، ونحن قادرون على العثور على المؤشرات الحيوية exوزوم لسرطانات البنكرياس في مرحلة مبكرة.
حالياً، نحن نوسع هذا الاكتشاف ليشمل أنواع أخرى من السرطانات وأمراض العدوى. عادة، العينات التي يتم التعامل معها في هذا الفحص هي إما عينات المريض أو عينات منقّاة اكسوزومات من خطوط الخلايا السرطانية، الأمر الذي يتطلب تدريباً خاصاً على السلامة.
