我们的原位协议非常重要，因为它提供了一种简单明了的方式，以最小的背景染色来可视化基因表达模式。这种技术使复杂和冗长的协议相对容易执行。提供台式设置的建议和检查表使此协议更易于正确执行和重现。
虽然此处显示的技术是特定于 Astyanax 墨西哥的，但它可能适用于其他大小相当的个人系统，对协议进行少量调整。首先，使用彩色实验室胶带为每个基因指定小瓶和移液器。使用巴斯德移液器，对胚胎进行排序。
通常每个小瓶不超过12个胚胎，一旦排序。接下来，设置一个震动水浴到70摄氏度。小心地在分类胚胎小瓶中抽出甲醇，代之以500微升的新鲜100%甲醇。
在平台摇床上短暂清洗胚胎约一分钟。在此之后，在增加浓度为 1x PBS 的胚胎中补充水分，并像文本协议中概述的 Tween 20 一样在平台摇床上。首先，将一个带网状底部的小垫片放入已预热至 70 摄氏度的旋转水浴中。
将杂交缓冲缓冲区减和杂交缓冲器加的等分放入垫片中。轻轻添加准备好的PK溶液到胚胎瓶，确保所有组织完全覆盖在溶液中。将小瓶转移到平台摇床中，让它们在蛋白酶 K 工作溶液中消化约 12 分钟。
在此之后，轻轻抽出 PK 溶液，用 PBT 短暂淹没小瓶以稀释剩余的 PK。用 500 微升新鲜 PBT 更换 PBT 溶液，让该溶液在平台摇床上冲洗五分钟。然后用 500 微升解冻 4%PFA 的 PBT 溶液进行更换。让胚胎在室温下在平台摇床上孵育20分钟。
要开始预杂交，在含胚胎小瓶中加入500微升预谋杂交缓冲液减去溶液。在70摄氏度下小心地将小瓶放入水浴的垫片中，无需摇晃5分钟。接下来，从杂交缓冲液减去溶液中抽出，用 500 微升预谋杂交缓冲液加溶液淹没小瓶。
将小瓶放回水浴的垫片中，并经过四个小时或一夜的摇晃孵育。要开始杂交，请从小瓶中抽出杂交缓冲液加，代之以 500 微升的新鲜预谋杂交缓冲液加。小心地将两个微升的RNA探针添加到每个小瓶中，轻轻旋转，以确保探针的均匀分布。
在水浴中孵育，在70摄氏度下过夜，同时在40 RPM下摇晃。首先，准备标有杂交缓冲液的微离心管，以及文本协议中概述的感兴趣的RNA探针基因。设置两个 15 毫升锥形管，并添加 0.2 克阻解试剂和 10 毫升 MABT。
将两根管放在螺母混合器上，直到试剂完全溶解在溶液中。使用玻璃巴氏移液器从杂交缓冲液加探针溶液中抽出，并放入无菌标记的微离心管中。将这种管子存放在零下20摄氏度的冰柜中，供将来使用。
小心地加入500微升的温盐水柠檬酸钠和杂交缓冲液减去稀释。在摇水浴中连续孵育10分钟，然后在室温下在平台摇床上，如文本协议中所述。最后一次孵育后，用500微升的MABT将每个小瓶中的100%PBT更换。
重复此过程两次，每次五分钟。首先，从每个小瓶中去除 MABT，并从 15 毫升锥形管中用预混的阻塞溶液将其淹没。在室温下将两个小瓶放在螺母搅拌机上四小时。
将抗体片段的两微升添加到第二管准备好的阻尼溶液中，并短暂涡流。然后用阻塞溶液将每个小瓶完全填充，并在四摄氏度的冰箱中放入坚果搅拌机过夜。首先，在 MABT 中准备 10%NGS 的库存小瓶。
用此 NGS 溶液的 500 微升更换每个小瓶中的阻塞溶液。在平台摇床的室温下孵育25分钟。在此之后，用 500 微升 100%MABT 更换 NGS 混合物。
在室温下在平台摇床上孵育30分钟。每天重复冲洗11次，每30分钟冲洗一次。然后用 100%MABT 填充每个小瓶，并在 4 摄氏度的冰箱中将它们放在坚果搅拌机上过夜。
首先，用一毫升的AP缓冲液更换每个小瓶中的MABT，让它洗涤五分钟。重复此洗涤两次，以完全去除 MABT。然后用一毫升的新鲜 AP 缓冲液替换 AP 缓冲液，该缓冲器包含 3.5 微升 BCIP 和 4.5 微升的 MBT。
在反应完成之前，每小时用含有 BCIP 和 MBT 的 AP 缓冲液重新混合，确保密切监测反应，并每 15 分钟检查一次，直到达到所需的染色水平。如协议所述，在AP缓冲液中以1X PBT浓度增加的胚胎冲洗，停止着色反应。在螺母搅拌器上以大约 5 毫升 100%PBT 的 5 毫升冲洗胚胎，直到达到所需的最小背景染色。
冲洗完成后，在平台摇床上用 500 微升无菌 PBS 清洗胚胎，然后根据文本协议中概述的样本进行后修复。冲洗胚胎后，将它们放在四毫升100%无菌PBS中，如果需要，在4摄氏度下长期储存。在这项研究中，胚胎阿斯蒂纳克斯标本被标记为高质量的基因表达分析。
这个过程已经成功地在帕洪洞穴鱼和表面鱼胚胎中实施。标有Sox9表达的洞穴鱼胚胎在发育中的分支拱门和胸鳍中表现出清晰的标记。请注意，在蛋黄囊或侧翼发育的索米特中，染色几乎不存在。
同样，Tfap2a表达在发育中的头部部分明显，作为早期迁移神经峰细胞沿胚胎的后侧翼区域。为洞穴鱼胚胎提供的第三个基因Phf20a出现在体细胞间皮和后头部分，这些部分注定要产生骨质组织。标有CXCR的表层鱼胚胎在头部和侧翼的隔离区域以及一些覆盖蛋黄囊的单个细胞中显示阳性标记。
基因Adcyap1a在中枢神经系统区域（包括垂体细胞）中表达。请注意在胚胎的后面配对的双边细胞簇中高度特异性的表达，以及中线表达的较大区域。最后一个检查的洞穴鱼胚胎基因，Sox10，是早期神经波峰在后侧胚胎和右侧的标记。
就地完成后，我们通常使用光显微镜对结果进行成像。最好在完成后两周内完成，以避免染色的降解。
